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PRRSV全长感染性cDNA克隆的构建：非结构蛋白和结构蛋白之间编码区的分离

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中国科学（C辑） 2008年第1期38卷 66-73页

作者：袁世山韦祖樟中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点研究室上海200232

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是近两年来流行于我国大部分省份的"猪高热综合征"的主要病原体.该病毒在繁殖过程中具有遗传多变性和高频率的抗原突变.如何设计有效的疫苗来防治... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是近两年来流行于我国大部分省份的"猪高热综合征"的主要病原体.该病毒在繁殖过程中具有遗传多变性和高频率的抗原突变.如何设计有效的疫苗来防治持续多变的流行变异株是研究者所关注的焦点.本研究中我们构建了Ⅱ型PRRSV弱毒株的感染性cDNA克隆,并对编码结构蛋白的ORF1和编码结构蛋白的ORF2之间插入几个酶切位点.通过RT-PCR和DNA测序以及分子克隆方法,获得了细胞致弱株(APRRS)的全长cDNA克隆.APRRSV基因组RNA为15521个核苷酸(不包括poly(A)尾).与PRRSV Nsp株和疫苗株的相似性均为99.7%.根据测序结果,利用基因组上的酶切位点将全长PRRSV cDNA克隆到pBlueScript载体中,在病毒5′末端引入T7启动子序列.为了区分重组病毒和亲本病毒,在ORF5编码区引人MluⅠ酶切位点.将最初构建的全长cDNA和带有MluⅠ酶切位点的cDNA分别体外转录成RNA后转染MA-104,均能够观察到典型的细胞病变(cytopathic effect,CPE).拯救的重组病毒与亲本病毒有着相同的病毒学特性.通过突变PCR的方法将编码非结构蛋白基因ORF1和编码结构蛋白基因ORF2-7之间的编码区分离,从而构建了克隆***体外转录产物具有感染性,而且拯救的病毒与亲本病毒具有相同的病毒学特性.本研究为构建嵌合病毒作为疫苗候选株以此对遗传多变的PRRSV毒株提供有效的交叉保护提供了宝贵的工具,同时也为建立PRRSV为基因表达载体来构建针对其他重要的猪源疾病重组疫苗搭建了一个很好的平台.

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 反向遗传系统编码区非结构蛋白

广西巴马小型猪白细胞介素-2和γ-干扰素的克隆与原核表达

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广西巴马小型猪白细胞介素-2和γ-干扰素的克隆与原核表达

作者：韦祖樟广西大学

学位级别：硕士

猪白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)是猪体内重要的细胞因子,在猪抗病和免疫应答反应中占有重要地位。本实验将广西巴马小型猪外周血淋巴细胞在刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养15h后,提取激活的淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术... 详细信息

猪白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)是猪体内重要的细胞因子,在猪抗病和免疫应答反应中占有重要地位。本实验将广西巴马小型猪外周血淋巴细胞在刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养15h后,提取激活的淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增出猪IL-2cDNA和IFN-γ cDNA,克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果显示:克隆的IL-2 cDNA全长为513个碱基,开放阅读框(ORF)为465个碱基,编码154个氨基酸。与报道其它品种猪的IL-2同源性为100%。克隆的的IFN-γ cDNA全长为556个碱基,开阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸。与报道其它品种猪的IFN-γ同源性为100%。证实克隆到了巴马小型猪IL-2基因和IFN-γ基因的cDNA。为了亚克隆编码猪IL-2和IFN-γ成熟蛋白基因,设计两对引物。扩增产物分别命名mIL-2和mIFN-γ。为了检测目的蛋白的表达,设计另外两对引物,使这两对引物带上21个核苷酸组成的血凝素序列,可以通过检测血凝素标签来检测融合蛋白的表达,将扩增带上血凝素的猪IL-2和IFN-γ成熟蛋白基因分别命名为HA-mIL-2和HA-mIFN-γ。将猪mIL-2、mIFN-γ、HA-mIL-2和HA-mIFN-γ插入PET质粒上,构建了原核表达质粒PET-mIL-2、PET-HA-mIL-2、PET-mIFN-γ和PET-HA-mIFN-γ,并转化大肠杆菌BL21,以BamHI/HindⅢ酶切筛选鉴定转化子,用IPTG诱导融合蛋白表达。通过SDS-PAGE分析,PET-mIL-2、PET-HA-mIL-2在34KD处出现融合蛋白条带,PET-mIFN-γ和

关键词：巴马小型猪白细胞介素-2 γ-干扰素克隆原核表达

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马动脉炎病毒分子生物学研究进展

病毒学报 2008年第5期24卷 404-408页

作者：韦祖樟袁世山中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病防治研究室上海200232

马动脉炎病毒(Equine Arteritis virus,EAV)与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respirtory syndrome virus,PRRSV)、鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV)、以及猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)同属于尼多病毒目(Nidovirale)、动脉炎病毒科(Atteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。[第一段]

关键词：病毒分子生物学马动脉炎病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒 virus 乳酸脱氢酶

套式病毒目病毒核衣壳蛋白的结构与功能研究进展

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中国兽医科学 2010年第9期40卷 984-988页

作者：谭菲菲韦祖樟袁世山中国农业科学院上海兽医研究所动物传染病研究室上海200241

介绍了套式病毒目病毒的分类及其基因组特点,论述了核衣壳(N)蛋白的结构及其功能特性,包括N蛋白的RNA结合特性、N蛋白的核定位特性、N蛋白在病毒复制中的作用,并就其在冠状病毒和动脉炎病毒中的不同作用进行了着重阐述。

关键词：套式病毒目病毒核衣壳蛋白结构功能

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马动脉炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

中国兽医学报 2009年第2期29卷 139-142页

作者：韦祖樟袁世山中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室上海200232

根据马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)Bucyrus株全基因组序列设计并合成EAV特异引物,进而应用RT-PCR技术分6段扩增了EAV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段PE124、PE631、PE1854、PE5191、PE61107、PE97Q分别克隆到载体PCR BluntⅡ-TOPO中,建立了EAV初级cDNA克隆。在扩增5′末端时,引入NotⅠ酶切位点和T3启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入XhoⅠ酶切位点,后者供cDNA模板的线性化之用。将扩增片段在PCR BluntⅡ-TOPO中依次连接,最后亚克隆到质粒pBluescriptⅡKS(+)中,获得了EAV全长基因组cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明:该毒株基因组全长为12 704个核苷酸,与EAVBucyrus分离株的同源性为99.1%;全长基因组中有104个核苷酸发生突变,相应地导致编码区内34个氨基酸的改变。

关键词：马动脉炎病毒全长cDNA克隆感染性克隆

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猪繁殖与呼吸综合症病毒分子生物学研究进展

微生物学通报 2008年第3期35卷 408-413页

作者：韦祖樟孙志袁世山中国农业科学院上海兽医研究所/中国动物卫生与流行病学中心上海分中心动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点研究室上海200232

猪繁殖与呼吸综合症病毒是引起猪繁殖与呼吸综合症的病原体,本文对PRRSV的基因组结构、病毒的非结构蛋白和结构蛋白的及其功能的分子生物学研究进展做了简要综述。

关键词：猪繁殖与呼吸病毒分子生物学动脉炎病毒

非结构蛋白2高变区在PRRSV复制中的作用

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中国兽医科学 2012年第10期42卷 991-997页

作者：吕健韦祖樟高飞郑海红童光志袁世山中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心北京100193

为了研究nsp2的非必需区在动脉炎病毒复制中的作用,采用定点突变PCR(site direct PCR)法对PRRSV全长感染性克隆pAPRRS的nsp2进行了系列缺失。结果显示,通过病毒拯救发现,nsp2部分区段可以忍受一定程度的缺失,但大幅度的缺失影响了病毒... 详细信息

为了研究nsp2的非必需区在动脉炎病毒复制中的作用,采用定点突变PCR(site direct PCR)法对PRRSV全长感染性克隆pAPRRS的nsp2进行了系列缺失。结果显示,通过病毒拯救发现,nsp2部分区段可以忍受一定程度的缺失,但大幅度的缺失影响了病毒的复制、RNA合成翻译甚至病毒颗粒的成熟过程。结果表明,nsp2中多个氨基酸的变化可能影响PRRSV中多聚蛋白的水解、加工、成熟或RTC的组装。

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒亲水区跨膜区病毒复制

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马动脉炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

马动脉炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：韦祖樟袁世山中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心动物传染病防治研究室农业部动物寄生虫病重点实验室

根据马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)Bucyrus株全基因组序列,设计并合成EAV特异引物,进而应用RT-PCR技术分6段扩增了EAV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片断PE124、PE631、PE1854、PE5191、PE61107、PE97Q分别克隆到载体PCR BluntII-TOPO中,建立了初级cDNA克隆。在扩增5’末端时,引入NotI酶切位点和T3启动子序列;在3’末段PolyA尾引入XhoI酶切位点,后者用于cDNA模板线性化。将扩增片断在PCR BluntII-TOPO中依次连接,最后亚克隆到质粒pBluescript II KS(+)中,获得了EAV全长cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明:该毒株基因组全长为12704个核苷酸,与EAV Bucyrus分离株的同源性为99.1%,全长基因组中有104个核苷酸发生突变,相应的导致编码区内34个氨基酸改变。本试验构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获取具有感染性的EAV分子克隆并研究动脉炎病毒基因组结构和功能奠定了基础。

关键词：马动脉炎病毒基因组序列核酸序列基因克隆

来源： cnki会议评论

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以PRRSV为载体表达外源基因的研究进展

中国动物传染病学报 2018年第1期26卷 89-93页

作者：李清清姚静韦祖樟广西大学动物科学技术学院南宁530005

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种以呼吸系统和繁殖障碍为特征的传染病,已被公认为影响全球养猪业的重要经济性疾病。目前,传统的活疫苗免疫是防控猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reprod... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种以呼吸系统和繁殖障碍为特征的传染病,已被公认为影响全球养猪业的重要经济性疾病。目前,传统的活疫苗免疫是防控猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的主要手段,但该疫苗的安全性和有效性还需进一步提高。本文就对近年来以PRRSV感染性克隆作为工具表达外源基因的重组病毒的研究进展做一综述。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒载体感染性克隆外源基因