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作者：金泗虎中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)是基底膜和细胞外基质的重要构成成分,由一个核心蛋白和数个与之共价连接的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)多糖侧链组成,其多糖侧链与多种生长因子和细胞因子相互结合并将这... 详细信息

硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)是基底膜和细胞外基质的重要构成成分,由一个核心蛋白和数个与之共价连接的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)多糖侧链组成,其多糖侧链与多种生长因子和细胞因子相互结合并将这些因子固定在细胞外基质和基底膜中,参与并影响一系列的病理和生理过程。肝素酶(heparanase, HPSE)是一种β-葡萄糖苷内切酶,可特异性的识别和切割硫酸肝素蛋白多糖的硫酸肝素侧链,破坏细胞外基质和基底膜,并释放结合于硫酸乙酰肝素上的细胞因子及各种酶类分子,促进肿瘤的发生转移和血管生成,参与机体的炎症过程和自身免疫病。由于肝素酶与肿瘤发生转移的密切相关性,肝素酶已经成为肿瘤治疗的靶标。大多数真核生物基因都是断裂基因,包含了内含子(intron)与外显子(exon)。其中内含子在基因转录成mRNA前体(pre-mRNA)后会被RNA剪接复合体(spliceosome)移除,剩下的外显子连接在一起形成成熟的mRNA,约半数的基因其外显子与蛋白质结构域、亚结构域或基序有很好的对应关系。选择性剪接是指通过选择性地识别pre-mRNA中不同的剪接位点,由一条pre-mRNA生成多条成熟mRNA的过程,pre-mRNA的选择性剪接是增加蛋白质多样性与基因表达复杂程度的主要原因,是机体满足各种发育阶段、各种生理环境需要的重要调控机制,也是引起许多遗传病及肿瘤发生的重要原因。对这一领域的深入研究将有可能解开许多尚未明了的遗传性疾病的发病机制,找到某些肿瘤早期诊断的分子标记物,并有可能为遗传病以及肿瘤的治疗找到新的靶位,开辟新的途径。本课题的目的是克隆存在于人外周血白细胞及各种肿瘤细胞中的肝素酶可变剪接体,并研究其亚细胞定位和生物学功能,为进一步明确肝素酶在肿瘤发生转移中的作用和肿瘤的治疗提供新的思路。课题的研究内容主要包括三个方面:一、从人外周血白细胞和肿瘤细胞中筛选肝素酶可变剪接体并测序鉴定;二、构建肝素酶可变剪接体的亚定位研究载体,在哺乳动物细胞中表达各种肝素酶可变剪接体,研究其亚细胞定位;三、构建肝素酶可变剪接体的功能研究载体,在哺乳动物细胞中表达并筛选稳定表达细胞株,用于以后进行成瘤实验、克隆形成实验和酶活性研究。首先,根据人肝素酶的cDNA序列设计引物,用RT-PCR方法从正常人外周血白细胞、胃癌细胞(SGC-7901)、肝癌细胞(SMMC-7721)和前列腺癌细胞(Du145)中扩增肝素酶基因及其各种可变剪接体,随后构建至pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行菌落PCR鉴定并测序。确定序列正确后,将肝素酶可变剪接体片段重组至pEGFP-N3质粒中(肝素酶位于融合蛋白的N端),实现肝素酶与绿色荧光蛋白的融合表达。将所构建的重组质粒分别转染HEK293FT细胞、B16F10细胞和CHO-K1细胞,通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中存在的位置确定肝素酶可变剪接体的亚细胞定位。最后,将肝素酶及其可变剪接体片段重组至pcDNA3.1(+)质粒上,转染U87细胞和MCF-7细胞并筛选稳定表达细胞株,通过PCR和Western方法鉴定所得到的细胞株。研究结果:①在实验中共克隆得到5种肝素酶可变剪接体,分别命名为splice5、splice6、splice5&6、splice9&10、splice10,其中后四种为本课题组首次发现,我们在GenBank数据库中注册并获得序列号,分别为FJ517659、FJ517660、GQ337901、GQ337902。其中,在人白细胞中,我们筛选得到了所有的5种肝素酶可变剪接体形式;在人胃癌细胞(SGC-7901)中,筛选得到了splice5、splice9&10;在人肝癌细胞(SMMC-7721)中,筛选得到了splice5;在前列腺癌细胞(Du145)中,筛选得到了splice10。②构建了肝素酶的定位研究载体pEGFP-HPSE/s5/s9&10/s10,转染HEK293FT细胞、B16F10细胞和CHO-K1细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现全长肝素酶以颗粒状形式定位于细胞质中,但肝素酶的可变剪接体splice5、splice9&10、splice10与全长肝素酶不同,以弥散形式定位于细胞质中。③构建了肝素酶的功能研究载体pcDNA- HPSE/s5/s9&10/s10,转染U87和MCF-7细胞,并用G418筛选,但始终未筛选得到稳定表达细胞株。在本课题的研究中,首次克隆到了4个未报道的肝素酶可变剪接体splice6、splice5&6、splice9&10、splice10。其中splice6、splice5&6和Splice10在选择性剪接的过程中分别缺失了第6

关键词：肝素酶可变剪接体硫酸肝素亚细胞定位克隆

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抗Rh(D)抗体制备的研究进展

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军事医学科学院院刊 2009年第6期33卷 586-589页

作者：金泗虎宫锋军事医学科学院野战输血研究所北京100850

RhD抗原是表达在人类红细胞表面的血型抗原,其在免疫原性和临床上的应用仅次于ABO血型系统,相应的抗Rh(D)抗体在血型鉴定和预防新生儿溶血等方面均具有重要意义。传统的抗Rh(D)多克隆抗体来自健康人的血清,由于来源受限和血浆制品的安... 详细信息

RhD抗原是表达在人类红细胞表面的血型抗原,其在免疫原性和临床上的应用仅次于ABO血型系统,相应的抗Rh(D)抗体在血型鉴定和预防新生儿溶血等方面均具有重要意义。传统的抗Rh(D)多克隆抗体来自健康人的血清,由于来源受限和血浆制品的安全问题,人们开始了抗Rh(D)的单克隆抗体和基因工程抗体的研究。国外研制的抗Rh(D)的单克隆抗体已成功用于血型鉴定,但到目前为止,还没有一个单克隆或者基因工程抗Rh(D)抗体作为多克隆抗Rh(D)抗体的替代品,在临床上用于预防Rh(D)免疫和新生儿溶血。本文对抗Rh(D)抗体制备的研究进展进行了综述。

关键词： RhD抗原抗体单克隆杂交瘤

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利用新型α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

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中国输血杂志 2011年第2期24卷 122-125页

作者：王玲燕高红伟金泗虎李素波虞立霞鲍国强宫锋军事医学科学院野战输血研究所北京100850

目的利用原核生物来源的α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造研究。方法应用PCR的方法从脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)中克隆了新型α-半乳糖苷酶基因,构建原核生物表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导α-半乳糖苷酶的胞内可溶性表... 详细信息

目的利用原核生物来源的α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造研究。方法应用PCR的方法从脆弱类杆菌(Bacteriodes fragilis)中克隆了新型α-半乳糖苷酶基因,构建原核生物表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导α-半乳糖苷酶的胞内可溶性表达,应用重组酶的上清液进行B型红细胞(RBC)初步酶解试验。结果重组酶分子量约为64.6 kD,超声破碎的菌液上清中的酶活力约为2 U/ml。在26℃及pH 6.8的等渗柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中2,h内完全酶解200μl B型RBC需要30μl的上清液,酶解后的B型RBC与抗-B和抗-A单克隆抗体不凝集,流式细胞术检测结果显示酶解后B型RBC的血型抗原呈现O型特征。结论重组的α-半乳糖苷酶可以有效的将B型RBC转变为O型RBC。

关键词： α-半乳糖苷酶血型改造 B抗原

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重组α-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌种稳定性研究

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中国输血杂志 2011年第3期24卷 197-200页

作者：高红伟李素波金泗虎王玲燕王颖丽张丽郁成雨季守平宫锋军事医学科学院野战输血研究所北京100850

目的探讨重组α-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌种的遗传稳定性。方法在有选择压力(AMP+)条件下,将重组a-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗... 详细信息

目的探讨重组α-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌种的遗传稳定性。方法在有选择压力(AMP+)条件下,将重组a-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力及Westernblotting检测。结果第0、20、40、60代菌的菌体形态、生长速度和抗生素抗性等与原代菌株无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100%;DNA测序未见α-N-乙酰半乳糖胺酶基因变异;SDS-PAGE图谱显示,α-NAGA表达水平无明显差别。Western blotting检测显示重组α-NAGA能与抗His的单抗特异结合。结论α-N-乙酰半乳糖胺酶重组质粒pET22b-α-NAGA在工程菌株中具有良好的遗传稳定性。

关键词： α-N-乙酰半乳糖胺酶重组工程菌菌种遗传稳定性传代

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重组血型改造工具酶稳定性的研究

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中国输血杂志 2010年第4期23卷 244-246页

作者：高红伟金泗虎王玲燕李素波檀英霞鲍国强徐丽娟章扬培宫锋军事医学科学院野战输血研究所北京100850 军事医学科学院附属医院输血科

目的研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性。方法以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60d,室温、4、-20、-7... 详细信息

目的研究血型改造工具酶,重组咖啡豆α-半乳糖苷酶在不同保存条件下的稳定性。方法以酶解B型红细胞的活性和纯度作为主要检测指标,考察重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。重组α-半乳糖苷酶在70℃条件下保存1d,37℃保存60d,室温、4、-20、-70℃分别保存6个月,定期取样观察样品的外观,检测样品的pH值、纯度、酶活性,并进行无菌试验;为确保临床使用中的安全性和有效性,我们对4℃保存的样品进行了长达3年的观察。结果重组α-半乳糖苷酶在70℃保存1d后失活,37℃保存2个月后活性降低了11.5%,室温保存6个月后活性降低了19%,-70℃保存6个月后活性降低了13%,4℃、-20℃保存的样品6个月内各项指标均正常,均未见蛋白明显降解,蛋白活性保持稳定。4℃保存3年的样品酶活性保持稳定,可按原剂量在26℃,2h内成功地将B型红细胞改造成O型红细胞。结论重组α-半乳糖苷酶对热不稳定,应保存4℃或-20℃,在此条件下,有效期至少2年,能满足常规临床要求。

关键词：重组α-半乳糖苷酶稳定性活性测定血型改造

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乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5在CHO细胞中的稳定转染及其亚细胞定位研究

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军事医学 2013年第7期37卷 514-516页

作者：顾懿高红伟李素波金泗虎鲍国强檀英霞王颖丽季守平裴雪涛宫锋广西医科大学南宁530021 军事医学科学院野战输血研究所北京100850

目的建立乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株,并进行亚细胞定位分析。方法将表达乙酰肝素酶全长的质粒和乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5质粒转染入CHO细胞,经G418进行筛选后,挑取单克隆进行培养,RT-PCR检测筛... 详细信息

目的建立乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株,并进行亚细胞定位分析。方法将表达乙酰肝素酶全长的质粒和乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5质粒转染入CHO细胞,经G418进行筛选后,挑取单克隆进行培养,RT-PCR检测筛选克隆。用激光共聚焦显微镜测定其亚细胞定位。结果成功获得乙酰肝素酶可变剪接体Splice 5稳定转染株,并研究了其亚细胞定位情况。野生型乙酰肝素酶以颗粒状分布于细胞质中,Splice 5以弥散状分布于细胞质中,且在内质网、高尔基体、溶酶体、细胞膜均有分布。结论 Splice 5和野生型乙酰肝素酶在CHO细胞中分布形式和定位的不同,提示Splice 5可能具有其他的生物学功能。

关键词：乙酰肝素酶可变剪接体转染亚细胞定位

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原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究

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中国实验血液学杂志 2011年第2期19卷 503-507页

作者：高红伟李素波鲍国强檀英霞王玲燕金泗虎王颖丽季守平宫锋军事医学科学院野战输血研究所北京100850

本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造。在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷... 详细信息

本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造。在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化。利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞。结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D600为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时。纯化后α-半乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg。该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞。结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶。

关键词：基因重组α-半乳糖苷酶血型改造 B→O血型改造

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肝素酶超表达对HEK293细胞中Arc基因的调节

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生物技术通讯 2011年第4期22卷 501-503页

作者：虞立霞金泗虎李素波高红伟宫锋军事医学科学院野战输血研究所北京100850

目的:利用RT-PCR验证基于肝素酶转基因小鼠的大脑皮层组织表达芯片发现的表达上调基因Arc,研究肝素酶基因Hpse对Arc基因表达的影响。方法:在稳定转染小鼠肝素酶基因Hpse的HEK293细胞体系中,采用半定量PCR的方法分析Arc的mRNA表达情况。... 详细信息

目的:利用RT-PCR验证基于肝素酶转基因小鼠的大脑皮层组织表达芯片发现的表达上调基因Arc,研究肝素酶基因Hpse对Arc基因表达的影响。方法:在稳定转染小鼠肝素酶基因Hpse的HEK293细胞体系中,采用半定量PCR的方法分析Arc的mRNA表达情况。结果:与前期的小鼠大脑皮层表达芯片结果相反,Hpse下调Arc基因的表达。结论:推断肝素酶可能通过影响Arc基因的表达,从而影响细胞功能。

关键词：肝素酶 Arc基因过表达 RT-PCR

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肝素酶基因可变剪接体的克隆及鉴定

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生物技术通讯 2010年第5期21卷 670-672页

作者：金泗虎虞立霞高红伟李素波王玲燕鲍国强宫锋军事医学科学院野战输血研究所北京100850

目的:克隆肝素酶基因的可变剪接体并测序。方法:根据人肝素酶的cDNA序列设计引物,用RT-PCR方法从正常人外周血白细胞中扩增肝素酶基因的可变剪接体,构建至pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并进行序列测定。... 详细信息

目的:克隆肝素酶基因的可变剪接体并测序。方法:根据人肝素酶的cDNA序列设计引物,用RT-PCR方法从正常人外周血白细胞中扩增肝素酶基因的可变剪接体,构建至pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并进行序列测定。结果:获得了肝素酶基因的3种可变剪接体形式,即5号外显子缺失可变剪接体、6号外显子缺失可变剪接体、5和6号外显子缺失可变剪接体,其中后2种可变剪接体尚未报道。结论:克隆了肝素酶基因的3种可变剪接体,有助于研究各种肝素酶可变剪接体编码蛋白的结构和功能及其在肿瘤发生转移过程中的作用。

关键词：肝素酶可变剪接体克隆

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CD44^+CD24^(-/low)乳腺癌干细胞的流式分选及其肿瘤干细胞特性的初步鉴定

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生物技术通讯 2012年第1期23卷 56-59页

作者：王玲燕王斌马清华金泗虎高红伟李素波卞修武宫锋军事医学科学院野战输血研究所北京100850 第三军医大学西南医院病理研究所和西南癌症中心重庆400038

目的:通过表面标志分选法富集乳腺癌干细胞,并初步鉴定其肿瘤干细胞特性。方法:采用流式细胞分选术从人乳腺癌细胞系MCF-7中分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞,并进行干细胞比例分析;用免疫荧光法检测、比较分选获得的细胞和对照细胞的干... 详细信息

目的:通过表面标志分选法富集乳腺癌干细胞,并初步鉴定其肿瘤干细胞特性。方法:采用流式细胞分选术从人乳腺癌细胞系MCF-7中分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞,并进行干细胞比例分析;用免疫荧光法检测、比较分选获得的细胞和对照细胞的干性和分化标记物Oct-4、SOX-2、CK-18和α-SMA的表达状态。结果:分选获得的CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞阳性比例达90%以上;免疫荧光检测结果显示,CD44+CD24-/low细胞亚群比non-CD44+CD24-/low细胞亚群高表达干细胞转录因子Oct-4、SOX-2,低表达分化因子CK-18、α-SMA;体外实验表明,CD44+CD24-/low细胞亚群具有更强的成球生长能力,并具有双向分化潜能。结论:CD44+CD24-/low表面标记物分选的方法可以富集高纯度的乳腺癌干细胞,且呈现干性因子Oct-4和SOX-2高表达。

关键词：乳腺癌干细胞流式细胞分选细胞分化,细胞表面分子标记

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