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硫酸软骨素AC酶的克隆表达及性质研究

硫酸软骨素AC酶的克隆表达及性质研究

作者：郭莉滨江苏大学

学位级别：硕士

硫酸软骨素AC酶(ChonAC)是一类糖胺聚糖裂解酶,可以通过β-消除机制切断连接半乳糖胺和葡萄糖醛酸β,1→4糖苷键,从而降解能降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素C及透明质酸等糖胺聚糖,生成一系列寡糖,主要是不饱和二糖。ChonAC可用于制备低分... 详细信息

硫酸软骨素AC酶(ChonAC)是一类糖胺聚糖裂解酶,可以通过β-消除机制切断连接半乳糖胺和葡萄糖醛酸β,1→4糖苷键,从而降解能降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素C及透明质酸等糖胺聚糖,生成一系列寡糖,主要是不饱和二糖。ChonAC可用于制备低分子量硫酸软骨素、肝素尾料的处理、硫酸软骨素寡糖结构的分析以及脊髓损伤的治疗。本文克隆了三种不同菌种来源的ChonAC,构建了含有6×His的重组质粒,并在大肠杆菌中进行异源表达,获得比活力高的ChonAC,对其表达条件进行优化,并研究其酶学性质,通过分子对接对酶分子和底物分子之间的相互作用进行研究,主要研究内容如下:1)筛选到来源于Pedobacter ***626、Pedobacter rhizosphaerae DSM18610和Pedobacter xixiisoli的三种ChonAC,分别命名为PschonAC、PrchonAC和PxchonAC,编码702、701和699个氨基酸残基。BLAST结果显示三种ChonAC与来源于Flavobacterium heparinum的ChonAC(Fhchon AC)的序列一致性分别为43.5%、63.48%和52.65%。构建三种重组表达载体pET-28a-ChonAC,并在大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。2)对三种ChonAC的表达条件进行优化。PschonAC的最适诱导温度为15 C,IPTG浓度为30μM,诱导时间为30 h,得到的粗酶活力为150 U L,经Ni-NTA纯化后的比活力为35 U mg,SDS-PAGE结果显示明显单一的蛋白条带,分子量76.08 k Da。PrchonAC的最适诱导温度为20 C,IPTG浓度为0.1m M,诱导时间为12h,得到的粗酶活力1500 U L,经Ni-NITA纯化得到一条明显的目的蛋白条带,分子量为77 k Da,比活力150 U mg。PxchonAC的最适IPTG浓度为0.1 m M,诱导温度为25 C,诱导时间为15h,得到的粗酶活力5082 U L,通过Ni-NTA纯化得到的单一的蛋白条带,分子量为76.8k Da,比活力428.77 U mg。3)对三种重组ChonAC的酶学性质进行研究。PschonAC在50 m M,p H 7.5的PBS缓冲液中相对酶活力最高。PschonAC催化反应的最适温度为25 C,在此温度下的半衰期200 min,大部分金属离子对酶活力无明显影响,Co对PschonAC的酶活力有抑制作用。PschonAC的K和V分别为0.37 mg m L和39.2 U mg,PschonAC在4 C下储存18天后能保持初始活力的64%。PrchonAC催化反应的最适反应条件为:35 C,20 m M p H7.5 Tris-HCl,20m M Ca。以硫酸软骨素A、C和透明质酸为底物,K值分别为1.68、0.14和0.34 mg m L,V分别为479.39、24.46和124.36 U mg。PrchonAC在25 C中的半衰期有20 min,在4 C中储存10天后,仍保留初始活力的90%以上。PxchonAC在降解硫酸软骨素A时最适反应温度和p H分别为40 C和p H 8.0 Tris-HCl。以硫酸软骨素A为底物,PxchonAC的K和V分别为0.61 mg m L和670.18 U·mg。Ca对PxchonAC酶活力有明显的促进作用,且在Ca的存在下,PxchonAC在37 C的半衰期提高了6.3倍,PxchonAC的酶活力在Zn的存在下降94.3%。PxchonAC在25和37 C的半衰期分别为3,300和660 min,在4 C储存时的半衰期有27天。4)分子结构研究。以Fhchon AC(PDB:1CB8)为模板,在Swiss-Model上进行同源建模得到三种蛋白模型通过Saves对模型评估得到的拉式图结果显示,PschonAC、PrchonAC和PxchonAC在允许区的氨基酸均达到99.8%,表明三种蛋白模型均合理。通过分子对接结果表明,PschonAC中参与催化反应的氨基酸残基有:Asn125、Trp126、Asn175、His225、Ser233、Tyr234、Arg288、Arg292和Asn374,这些氨基酸残基均为保守残基。PrchonAC与CS-A,CS-C和HA形成的氢键数分别是12,14和9个,PrchonAC与CS-C在活性口袋中形成了更多的氢键,这限制了底物在活性中心的延伸,导致酶活力下降,而透明质酸在半乳糖胺上缺少硫酸根部分,导致底物对酶的识别能力降低,这使得酶活力比以CS-A为底物的酶活力低35%。PxchonAC和PrchonAC均与Ca发生相互作用,但是PxchonAC与Ca形成的氢键数有5个,Pr

关键词：硫酸软骨素AC酶克隆表达性质表征分子对接低分子量硫酸软骨素

城乡统筹背景下重庆城市建设用地空间结构及人文驱动研究

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重庆第二师范学院学报 2015年第1期28卷 26-31,174页

作者：郭莉滨重庆第二师范学院 400065

以进入快速城市化阶段的重庆为研究区域,应用区位熵、洛伦兹曲线和基尼系数的基本原理,分析各区县和不同区域、不同等级城市建设用地的空间结构,并利用主成分分析法探索影响重庆市建设用地结构的人文因素。

关键词：城乡统筹建设用地空间结构人文驱动重庆

基于马尔可夫模型的城乡结合部地价规律研究——以北京市为例

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重庆第二师范学院学报 2014年第3期27卷 41-45,175页

作者：郭莉滨重庆第二师范学院重庆400065

马尔可夫模型是地理预测中常用的重要方法之一。利用马尔可夫链理论构建起地价预测模型,并以北京市城乡结合部为案例,对其地价的空间变化特征进行定量分析。模型测算结果显示,北京市不同方向上的地价变化趋势存在很大差异,表明北京城市... 详细信息

马尔可夫模型是地理预测中常用的重要方法之一。利用马尔可夫链理论构建起地价预测模型,并以北京市城乡结合部为案例,对其地价的空间变化特征进行定量分析。模型测算结果显示,北京市不同方向上的地价变化趋势存在很大差异,表明北京城市正处于非均衡的发展过程中。城乡结合部土地价格的变化情况较城市地价更加复杂,受到更多因素的影响。正是在多重因素作用下,形成了模型测算出的北京城乡结合部不同方向上地价迥异的变化规律。

关键词：马尔可夫模型城乡结合部地价北京市

基于主成分分析法的城市竞争力测度与评价研究——以重庆市四十个区县为例

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特区经济 2012年第6期 197-199页

作者：郭莉滨重庆教育学院重庆400065

城市竞争力是近几年国内外兴起的城市管理新课题。本文以重庆为例,通过构建城市竞争力评价指标体系,运用主成分分析法在对重庆40个区县进行定量分析,划分为辐射带动型、显性辐射型、弱性辐射型、隐性辐射型、带动辐射型五类区域的基础上... 详细信息

城市竞争力是近几年国内外兴起的城市管理新课题。本文以重庆为例,通过构建城市竞争力评价指标体系,运用主成分分析法在对重庆40个区县进行定量分析,划分为辐射带动型、显性辐射型、弱性辐射型、隐性辐射型、带动辐射型五类区域的基础上,从城市实力、城市能力、城市活力、城市潜力、城市魅力等方面提出增强城市竞争力的对策建议。

关键词：城市竞争力主成分分析法测度评价

重庆“江南万亿工业走廊”城市节点等级分布研究

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西部论坛 2012年第6期22卷 93-98页

作者：郭莉滨重庆第二师范学院重庆400065

根据点轴开发理论,借助多元统计分析方法,对"江南万亿工业走廊"城市节点的等级空间分布进行分析,得到该城市群的节点等级体系:一级节点(发达型城市)为万州区和涪陵区,二级节点(中等型城市)为巴南区和长寿区,三级节点(发展型城市)包括忠... 详细信息

根据点轴开发理论,借助多元统计分析方法,对"江南万亿工业走廊"城市节点的等级空间分布进行分析,得到该城市群的节点等级体系:一级节点(发达型城市)为万州区和涪陵区,二级节点(中等型城市)为巴南区和长寿区,三级节点(发展型城市)包括忠县、丰都、奉节、云阳、石柱和巫山。应在此基础上科学规划空间布局,构建网络化基础设施体系,加快集群工业发展,加速资源要素集聚,加强区域间协同合作,实现有效的点轴系统开发。

关键词：点轴开发理论点轴空间格局区域城市等级层次区域城市节点体系城市经济效益江南万亿工业走廊

多功能视角下的山区乡村空间功能分异特征及类型划分

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生态学报 2017年第7期37卷 2415-2427页

作者：洪惠坤谢德体郭莉滨胡蓉廖和平西南大学地理科学学院重庆400715 西南大学资源环境学院重庆400715 重庆第二师范学院重庆400065

以西部山区重庆乡村空间为研究对象,构建乡村空间多功能评价指标体系,将乡村空间多功能划分为农业生产功能、经济发展功能、生态保育功能、生态稳定性功能,社会保障居住家园功能五种子功能,采用熵权法定量核算2013年全市乡村空间功能值... 详细信息

以西部山区重庆乡村空间为研究对象,构建乡村空间多功能评价指标体系,将乡村空间多功能划分为农业生产功能、经济发展功能、生态保育功能、生态稳定性功能,社会保障居住家园功能五种子功能,采用熵权法定量核算2013年全市乡村空间功能值,运用GIS技术和Dagum基尼系数刻画重庆市不同地区乡村空间功能值地区差异特征,并划分了重庆市乡村空间多功能类型,研究结果表明:(1)山地型乡村地形复杂,景观类型多样,功能也极具多样性,研究区乡村空间除了生态稳定性功能外,其他各功能值具有显著的空间分异特征,有明显的空间集聚性。(2)Dagum基尼系数,是一种有效的技术方法,能够更为深入地刻画研究区乡村空间功能值地区间差异及区内差异特征。基尼系数测算及其分解结果显示,地区间差距是总体差距的主要来源,其贡献率都超过50%。(3)根据乡间空间多功能分布的差异性及山地乡村的特点和山区生态环境的脆弱性,将研究区乡村空间划分为农业生产-经济发展型,农业生产-人居生活型,人居生活-社会保障型,人居生活-经济发展型,水源涵养生态保育型,生态保育-经济发展型,生态保育-农业生产型,土壤保持生态保护型8种功能类型,能较好地体现地域特色,为科学健康的开发利用山地乡村空间土地资源提供有益借鉴,有利于区域协调可持续发展。

关键词：多功能山区乡村空间 Dagum基尼系数生态