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中医杂志 2010年第S1期51卷 132-133页

作者：邱桥成广东省河源市龙川县丰稔镇街道卫生站

沙门菌质粒毒力基因spvB突变株的构建及其对上皮细胞自噬的影响

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沙门菌质粒毒力基因spvB突变株的构建及其对上皮细胞自噬的影响

作者：邱桥成苏州大学

学位级别：硕士

目的：构建沙门菌质粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene B, spvB)突变株,通过上皮细胞感染模型,研究该基因对细胞自噬的影响,为探讨沙门菌质粒毒力基因spvB致病机制及减毒活疫苗的制备提供理论和实验依据,并为后续利用小鼠... 详细信息

目的：构建沙门菌质粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene B, spvB)突变株,通过上皮细胞感染模型,研究该基因对细胞自噬的影响,为探讨沙门菌质粒毒力基因spvB致病机制及减毒活疫苗的制备提供理论和实验依据,并为后续利用小鼠感染模型进一步研究该基因的功能提供工具和手段。方法：一.沙门菌质粒毒力基因spvB突变株的构建 1.根据GeneBank序列数据库中沙门菌质粒毒力基因spvB序列,用Primer Premier5.0设计PCR特异性引物,以鼠伤寒沙门菌标准株SR-11基因组为模板,扩增获得spvB基因缺陷性核苷酸片段后连接至自杀质粒PGMB151。将改建的自杀载体导入含有spvB基因的鼠伤寒沙门菌SR-11野生株中进行同源重组,用PCR方法挑选稳定传代的突变株并进行基因测序鉴定。 2.根据spvB基因序列设计引物,以鼠伤寒沙门菌标准株SR-11基因组为模板,通过PCR扩增获得含spvB基因编码区域的全长DNA,并与表达载体pBAD/gⅢ定向连接,转化至大肠杆菌TOP10中筛选阳性克隆质粒,经序列分析后将阳性重组载体电转化至spvB基因突变株,作为spvB基因突变回补株,用PCR、核酸测序及蛋白免疫印迹(Western blot, WB)鉴定。二.沙门菌质粒毒力基因spvB对上皮细胞自噬的影响 1.以携带spvB的鼠伤寒沙门菌标准株SR-11,敲除spvB的鼠伤寒沙门菌突变株(SR-11-ΔspvB)及其回补株(SR-11-c-spvB),与稳定转染了带有红色和绿色荧光蛋白标记微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3, LC3)(mRFP-GFP-LC3)的HeLa细胞体外共培养,制作细胞感染模型。将对数生长期细菌按感染复数(multiplicity of infection, MOI)100:1感染细胞,在细菌和细胞共培养1h后吸除上清,此时定为“0”点。随后加入含100μg/ml阿米卡星(Amikacin, AMK)培养基作用2h以杀灭胞外菌,最后将AMK浓度降至10μg/ml以抑制从感染细胞中释放至培养基中的细菌生长。分别在共培养后1h、3h和5h收集细胞,用共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope, CLSM)观察胞内LC3-Ⅱ黄色点状结构。 2.以携带spvB的鼠伤寒沙门菌标准株SR-11,敲除spvB的鼠伤寒沙门菌突变株(SR-11-ΔspvB)及其回补株(SR-11-c-spvB)与HeLa细胞体外共培养,制作细胞感染模型。以对数生长期细菌按感染复数(multiplicity of infection, MOI)100:1感染细胞,在细菌和细胞共培养1h后吸除上清,此时定为“0”点,随后加入含100μg/ml阿米卡星(Amikacin, AMK)培养基作用2h以杀灭胞外菌,最后将AMK浓度降至10μg/ml以抑制从感染细胞中释放至培养基中的细菌生长。分别在共培养后1h、3h和5h收集细胞,用蛋白免疫印迹法(Western blot, WB)检测自噬相关蛋白Beclin-1和p62蛋白的表达情况,并用平板菌落计数法检测胞内集落形成单位(colony forming unit, CFU)。结果：一.沙门菌质粒毒力基因spvB突变株的构建 1.经PCR和基因测序证实,成功获得了spvB基因缺陷的鼠伤寒沙门菌突变株SR-11-AspvB。 2.经PCR、基因测序和WB证实,成功获得了spvB基因突变回补株SR-11-c-spvB。二.沙门菌质粒毒力基因spvB对上皮细胞自噬的影响 ***检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ结果显示,细菌和细胞共培养1h后,SR-11和回补株SR-11-c-spvB感染组细胞内LC3-II的黄色荧光点状聚集数明显低于SR-11-ΔspvB感染组(P0.05)。在细菌和细胞共培养的各时间点,SR-11和回补株SR-11-c-spvB感染组细胞内LC3-II的黄色荧光点状聚集数无明显差异(P>0.05)。 ***检测结果显示,在细菌和细胞共培养1h后,SR-11和SR-11-c-spvB感染组细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达低于SR-11-ΔspvB感染组(P0.05)。在细菌和细胞共培养1h后,SR-11和SR-11-c-spvB感染组细胞自噬相关蛋白p62表达高于SR-11-AspvB感染组(P0.05)。CFU结果显示,在细菌和细胞共培养1h后,各感染组间胞内活菌数无明

关键词：沙门菌质粒毒力基因spvB 上皮细胞自噬

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肝癌现实医治病例录

中医临床研究 2017年第25期9卷 47-49页

作者：邱桥成深圳市龙华新区三联社区义诊队广东深圳518110

肝病是一种常见的危害性极大的疾病。本文主要论述了笔者治疗肝癌的案例,以飨同道。

关键词：导管肝动脉化疗栓塞术肝癌微波消融术活血化痰解毒

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肝硬化及肝纤维化是胆石病形成原因之一

中医临床研究 2017年第26期9卷 45-47页

作者：邱桥成深圳市龙华新区三联社区义诊队

在医治肝硬化患者过程中,特别是在一些肝纤维化患者自我感觉良好,医学检验科检验报告也都好转的情况下,但医学影像的报告还是和初次医学影像的报告一样。肝硬化特别是肝脏弥漫性改变,在好转中后期超声检查时都会有"胆结石"的报告。

关键词：肝硬化肝脏弥漫性改变胆结石养血柔肝活血化瘀

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浅谈难治病从肾入手

中医临床研究 2011年第13期3卷 86-86,88页

作者：邱桥成广东省龙川县丰稔镇十二排街道居委会卫生站广东丰稔517369

本文是笔者以两例真实的病例来讲述,在农村中诊病时遇到一些难治的病是如何从"肾"入手,用中医中药进行辨证,辨症施治。实际上也是笔者对中医"学习-临床-学习"的心得体会。

关键词：肾辨证用方辨症用药

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对民间的“流民方”使用的收获

中医临床研究 2016年第31期8卷 89-90页

作者：邱桥成龙川县丰稔镇十二排街道居委会卫生站广东河源517369

本文讲作者在使用民间"流民方"时的收获和感想,同时也讲明"流民方"的来源和怎样的方叫"流民方"。既然是"方",在使用时也一样要辨证施治(用方)、辨症施治(用药)。

关键词： “流民方” 收获

靶向转录信号传导子与激活子-3基因的RNAi对人结肠癌细胞HCT116侵袭能力的影响

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苏州大学学报（医学版） 2011年第6期31卷 917-921页

作者：蒋剑岑建农邱桥成江阴市人民医院普外科江苏江阴214400 苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所江苏苏州215006

目的探讨抑制靶向转录信号传导子与激活子-3(STAT-3)基因表达对结肠癌细胞增殖以及侵袭转移行为的影响。方法实验分三组:空白对照组、转染NC-siRNA(阴性对照组)及转染特异性STAT-3-siRNA组(RNAi组)。人结肠癌细胞HCT116瞬时转染特异性si... 详细信息

目的探讨抑制靶向转录信号传导子与激活子-3(STAT-3)基因表达对结肠癌细胞增殖以及侵袭转移行为的影响。方法实验分三组:空白对照组、转染NC-siRNA(阴性对照组)及转染特异性STAT-3-siRNA组(RNAi组)。人结肠癌细胞HCT116瞬时转染特异性siRNA,24、48、72 h后MTT法检测三组细胞的增殖活性,48 h后RQPCR检测STAT-3基因mRNA表达。RQ-PCR及细胞免疫化学法检测MMP-9在mRNA和蛋白水平的表达,Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力。结果 RNAi组与其他两组相比细胞增殖受抑明显(均P0.05)。结论下调STAT-3基因表达可有效抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭转移,抑制MMP-9在mRNA和蛋白水平的表达。沉默STAT-3基因抑制结肠癌细胞侵袭能力的机制之一可能是通过下调MMP-9途径。

关键词：转录信号传导子与激活子-3 RNA干扰结肠癌增殖转移

G-CSF对急性淋巴细胞白血病细胞增殖活性的影响及协同化疗药物杀伤作用的实验研究

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中华血液学杂志 2011年第1期32卷 61-63页

作者：薛胜利戴兰陈艳邱桥成陈苏宁孙爱宁吴德沛苏州大学附属第一医院、江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室215006

我们在临床实践中观察到低剂量的CAG预激方案对难治或复发急性淋巴细胞白血病（ALL）尤其是T-ALL显示出了较好的疗效.考虑到该方案最初是为髓系白血病设计,且其主要原理是G-CSF通过其受体（G-CSFR）介导,驱动G0期白血病细胞进入增殖周... 详细信息

我们在临床实践中观察到低剂量的CAG预激方案对难治或复发急性淋巴细胞白血病（ALL）尤其是T-ALL显示出了较好的疗效.考虑到该方案最初是为髓系白血病设计,且其主要原理是G-CSF通过其受体（G-CSFR）介导,驱动G0期白血病细胞进入增殖周期进而增强化疗药物的杀伤作用.我们推测G-CSF以类似的作用方式对ALL细胞发挥作用.

关键词：急性淋巴细胞白血病 G-CSF 杀伤作用化疗药物细胞增殖活性实验研究协同髓系白血病

抑制素受体和激活素受体在正常卵巢皮质上的表达及其意义

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中华妇产科杂志 2008年第4期43卷 276-280页

作者：朱蕊沈宗姬陈友国邱桥成徐文新苏州大学附属第一医院妇产科 215006

目的探讨卵泡期和黄体期抑制素受体β-多糖、抑制素结合蛋白（INHBP）和激活素受体（ACTR）在正常卵巢皮质上的表达变化及其与内分泌激素水平的关系。方法采用实时荧光定量PCR和免疫组化方法检测21例卵泡期（卵泡期组）和21例黄体期（... 详细信息

目的探讨卵泡期和黄体期抑制素受体β-多糖、抑制素结合蛋白（INHBP）和激活素受体（ACTR）在正常卵巢皮质上的表达变化及其与内分泌激素水平的关系。方法采用实时荧光定量PCR和免疫组化方法检测21例卵泡期（卵泡期组）和21例黄体期（黄体期组）正常卵巢皮质中β-多糖、INHBP和ACTR基因表达水平，采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验（ELISA）测定外周血血清雌二醇、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、抑制素B（INHB）、激活素A（ACTA）水平，并进行受体基因表达水平与激素水平间的相关性分析。结果（1）卵泡期组ACTRIA、ACTRIB、ACTRIIA、ACTRIIB基因表达水平分别为0．50±0．17、0．050±0．019、0．10±0．04、0．28±0．10，黄体期组分别为0．36±0．18、0．036±0．020、0．07±0．04、0．19±0．11，两组分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。卵泡期组β-多糖基因表达水平为0．26±0．10，黄体期组为0．17±0．09，两组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。（2）卵泡期组卵巢皮质ACTRIA、ACTRIIA、β-多糖染色强度均高于黄体期组，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。（3）卵泡期组β-多糖基因表达水平与血清雌二醇、FSH、LH、INHB水平均呈正相关关系[r分别为0．53（P〈0．05）、0．74（P〈0．01）、0．85（P〈0．01）、0．76（P〈0．01）]。结论在卵泡期正常卵巢皮质上抑制素、激活素通过受体途径发挥抑制或促进FSH分泌的作用，从而影响卵泡发育。

关键词：卵巢抑制素类激活素受体多糖类卵泡期黄体期

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TIMP-2逆转录病毒载体的构建及表达

苏州大学学报（医学版） 2006年第2期26卷 185-187,199页

作者：李振江陈子兴岑建农何军邱桥成苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所江苏苏州215006

目的构建人组织型基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)编码序列基因逆转录病毒表达载体,转染人单核细胞白血病细胞株,为探讨TIMP-2的生物学功能奠定基础。方法根据基因库中已公布的序列设计引物,用PCR方法扩增出人TIMP-2编码序列基因片段,用... 详细信息

目的构建人组织型基质金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)编码序列基因逆转录病毒表达载体,转染人单核细胞白血病细胞株,为探讨TIMP-2的生物学功能奠定基础。方法根据基因库中已公布的序列设计引物,用PCR方法扩增出人TIMP-2编码序列基因片段,用限制性内切酶及T4连接酶将目的片段插入MSCV逆转录病毒载体中。采用酶切和PCR鉴定及测序后经脂质体介导转染至PT67包装细胞中,以病毒上清感染单核细胞白血病细胞株SHI-1,G418筛选,极限稀释法挑选单克隆细胞株,定量PCR和Western Blotting检测TIMP-2的表达。结果TIMP-2基因克隆进逆转录病毒载体MSCV中,经酶切、PCR和DNA测序证实重组逆转录病毒载体构建正确,病毒上清感染SHI-1细胞,经G418筛选并挑选出单克隆细胞,经实时定量PCR和Western Blotting检测发现SHI-1细胞中TIMP-2 mRNA及蛋白表达明显上调。结论成功构建了高表达TIMP-2的SHI-1细胞,可对其生物学行为作进一步研究。

关键词：组织型基质金属蛋白酶抑制剂2 聚合酶链反应逆转录病毒载体载体构建基因转染基因表达