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11种致牛腹泻病原一步法多重PCR/RT-PCR检测方法的建立

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微生物学通报 2024年

作者：金美君胡云皓辛凌翔刘燕潘瑶王秀丽赵浩然汤承陈曦李锦铨朱良全中国兽医药品监察所华中农业大学四川省甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所西南民族大学

【背景】单病原或多病原混合感染导致的牛腹泻综合征严重制约养牛业发展，病原快速准确诊断是防控该病的重要前提。【目的】建立11种致牛腹泻的细菌或病毒病原一步法多重PCR/RT-PCR检测方法，实现快速诊断病原。【方法】通过文献检索，... 详细信息

【背景】单病原或多病原混合感染导致的牛腹泻综合征严重制约养牛业发展，病原快速准确诊断是防控该病的重要前提。【目的】建立11种致牛腹泻的细菌或病毒病原一步法多重PCR/RT-PCR检测方法，实现快速诊断病原。【方法】通过文献检索，调查了引起牛腹泻病的主要病原及其高覆盖率的引物，选择以产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens） α-toxin、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica） invA、大肠杆菌（Escherichia coli） K99、牛肠道病毒（BEV） 5′-UTR、牛星状病毒（BAstV） ORF1a、牛轮状病毒（BRoV） VP6、牛嵴病毒（BKoV） D4、牛诺如病毒（BNoV） ORF1、牛冠状病毒（BCoV） N、牛环曲病毒（BToV） N、牛病毒性腹泻黏膜病病毒（BVDV） 5′-UTR为靶标序列的引物，通过温度梯度PCR及单一控制变量法优化退火温度、引物浓度、循环数，建立11种病原的多重PCR/RT-PCR检测方法，对该方法进行了特异性、灵敏度和重复性评价，并应用该方法进行临床样品检测。【结果】最佳退火温度为54.4 ℃，C. perfringens、S. enterica、E. coli K99、BEV、BAstV、BRoV、BKoV、BNoV、BCoV、BToV和BVDV对应基因片段最优引物浓度分别为0.2、0.25、0.25、0.2、0.25、0.25、0.35、0.5、0.25、0.25、0.3 μmol/L，最优循环数为35个循环。该方法特异性强，仅对靶标病原检测为阳性，对溶血性曼氏杆菌（Mansiella haemolyticus）、化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、牛支原体（Mycoplasma bovine）分离株等病原检测均为阴性；敏感性高，对重组质粒标准品最低检出限依次为7.5×103、7.5×104、7.5×103、7.5×101、7.5×104、7.5×102、7.5×103、7.5×102、7.5×102、7.5×104、7.5×103copies/μL；重复性好，批间与批内试验均一致。用该方法检测江苏地区临床样品490份，结果显示，BEV、BAstV、BRoV、BKoV、BNoV、BCoV、BToV、BVDV阳性率分别0.61%、0.41%、0.61%、0.21%、27.14%、3.27%、0.21%、1.02%。通过单重PCR对该多重PCR临床样品检测结果进行重复验证，结果显符合率为100%。随机挑选50个检测为阳性的PCR产物进行测序验证，结果均为相应病原的基因片段。【结论】成功建立一种同时检测11种牛腹泻主要病原的一步法多重PCR/RT-PCR检测方法。

关键词：牛腹泻细菌病毒多重PCR RT-PCR

羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验小鼠免疫攻毒法研究

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中国动物检疫 2024年第8期41卷 112-120页

作者：张一帜任小侠冯妍李建辛凌翔孙淼王豪杰佟仁冬朱良全刘燕中国兽医药品监察所北京100081

为解决羊败血性链球菌病灭活疫苗现行规程中效力检验采用靶动物免疫攻毒法所存在的动物筛选困难、动物质量不稳定、经济花费高等问题,开展了实验动物免疫攻毒替代方法研究。以靶动物免疫攻毒法为基础,确定该疫苗的最小保护剂量和不保护... 详细信息

为解决羊败血性链球菌病灭活疫苗现行规程中效力检验采用靶动物免疫攻毒法所存在的动物筛选困难、动物质量不稳定、经济花费高等问题,开展了实验动物免疫攻毒替代方法研究。以靶动物免疫攻毒法为基础,确定该疫苗的最小保护剂量和不保护临界剂量,并在确认小鼠品系后开展平行关系研究,从而筛选出在小鼠模型上能够体现疫苗差异的最佳攻毒剂量。结果显示:合格疫苗1/2稀释度为最小免疫剂量,1/4稀释度为不符合规定的临界剂量;KM小鼠为替代方法最合适的小鼠品系;最佳攻毒剂量为使用2 MLD混合菌液,对免疫组和对照组进行攻毒,对照小鼠全部死亡,免疫小鼠至少保护70%。本研究建立了羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验实验动物免疫攻毒替代方法,这将有助于提升该类疫苗效力检验的稳定性和可靠性,为羊败血性链球菌病防控提供有力支撑。

关键词：羊败血性链球菌病马链球菌兽疫亚种疫苗效力检验免疫攻毒法平行关系替代方法

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副猪嗜血杆菌4型灭活疫苗攻毒菌株的筛选

中国兽药杂志 2024年第1期58卷 6-12页

作者：刘元杰王秀丽李建辛凌翔朱良全张一帜姚文生刘燕中国兽医药品监察所北京100081

为筛选副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)4型攻毒菌株,对8株HPS进行血清型鉴定,并绘制细菌生长曲线;用豚鼠攻毒实验对其中5个菌株进行毒力测定,同时记录发病豚鼠的临床症状和剖检病变。结果显示8个菌株均为HPS4型,确定了候选菌株... 详细信息

为筛选副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)4型攻毒菌株,对8株HPS进行血清型鉴定,并绘制细菌生长曲线;用豚鼠攻毒实验对其中5个菌株进行毒力测定,同时记录发病豚鼠的临床症状和剖检病变。结果显示8个菌株均为HPS4型,确定了候选菌株的最佳扩大培养时间为8~10h,筛选出毒力最强的CVCC4355。本研究确定CVCC4355可作为HPS4型疫苗产品效力检验的攻毒菌株。

关键词：副猪嗜血杆菌4型筛选毒力测定

羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株对昆明小鼠的致病性研究

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中国兽药杂志 2024年第2期58卷 18-27页

作者：张一帜任小侠辛凌翔朱良全孙淼李建张媛冯妍王秀丽刘元杰刘燕中国兽医药品监察所(农业农村部兽药评审中心) 北京100081

为研究羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株对昆明系(KM)小鼠的致病性,使用羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株分别对昆明小鼠进行毒力测定,观察临床和剖检症状,对死亡小鼠进行细菌分离培养,并对典型菌落进行形态、生化特性以及PCR鉴定。毒力... 详细信息

为研究羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株对昆明系(KM)小鼠的致病性,使用羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株分别对昆明小鼠进行毒力测定,观察临床和剖检症状,对死亡小鼠进行细菌分离培养,并对典型菌落进行形态、生化特性以及PCR鉴定。毒力测定结果显示CVCC55001对于昆明小鼠的最小致死剂量为9 CFU,CVCC55002对于昆明小鼠的最小致死剂量为11 CFU。感染羊链球菌死亡小鼠主要剖检症状为肝脏出血、肠道液化性坏死、脾脏肿大,病理变化为肝细胞出现大量坏死、肠道黏膜层广泛自溶、脾脏组织广泛坏死出血。本研究建立了羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株的昆明小鼠攻毒感染模型,确定了最小致死剂量,对羊链球菌感染和致病性研究展开初步探索,为疫苗研究及评价提供了平台支撑。

关键词： CVCC55001 CVCC55002 细菌鉴定毒力测定小鼠模型

猪胞内劳森菌感染的免疫应答与检测技术研究进展

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微生物学报 2023年第3期63卷 871-880页

作者：王豪杰任小侠辛凌翔刘燕朱良全中国兽医药品监察所北京100081

胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)常引起猪精神不振、食欲减退、血样下痢或突然死亡,严重损害养猪业。猪群感染该菌在肠道诱导免疫应答的研究较少。因该菌胞内寄生,基于细菌不同感染阶段动物免疫应答特点,检测方法会有所侧重。... 详细信息

胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)常引起猪精神不振、食欲减退、血样下痢或突然死亡,严重损害养猪业。猪群感染该菌在肠道诱导免疫应答的研究较少。因该菌胞内寄生,基于细菌不同感染阶段动物免疫应答特点,检测方法会有所侧重。本文重点阐述了胞内劳森菌感染后机体免疫应答的特点,并对其检测技术进行综述,以期为新型检测技术研发及疫病防控提供参考。

关键词：胞内劳森菌猪免疫应答检测

牛巴氏杆菌病多重PCR检测技术的建立与应用

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微生物学通报 2022年第12期49卷 5083-5091页

作者：王豪杰辛凌翔任小侠刘燕姚文生侯雪霞李旭妮朱良全中国兽医药品监察所北京100081 永年区农业农村局河北邯郸057150

【背景】牛巴氏杆菌病是由血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一种严重危害养牛业的重要传染病,病原学聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法是诊断并防控该病的有效手段。【目的】建立检测血清... 详细信息

【背景】牛巴氏杆菌病是由血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一种严重危害养牛业的重要传染病,病原学聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法是诊断并防控该病的有效手段。【目的】建立检测血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌的多重PCR方法,为临床诊断牛巴氏杆菌病和病原分型提供技术支撑。【方法】参考多杀性巴氏杆菌hyaD-hyaC基因、bcbD基因和ecbJ基因特异区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定适宜退火温度(Tm);采用棋盘试验优化引物浓度并初步建立多重PCR方法;采用重组质粒标准品及阳性菌株菌液确定其敏感性(最小检测量);以8种常见牛感染病原体[溶血性曼氏杆菌(Mannheimia hemolytica)C1655、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)C237、产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes)C1597、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)C3053、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)C79351、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)C1625、牛传染性鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus)CAV1546和牛支原体分离株(Mycoplasma bovis)C65-1]核酸样本确定其特异性;制备3批诊断试剂,对敏感性和特异性样品进行批间和批内试验,确定其重复性;运用建立的方法使用3种不同型号的PCR仪检测敏感性和特异性样品,确定其适用性;通过检测临床样本及人工模拟感染样本评价临床应用效果。【结果】在Tm为55°C时,3对引物浓度分别为0.25、0.30和0.20μmol/L条件下建立多重PCR方法较优,可以同时检测多杀性巴氏杆菌血清A型(821 bp)、血清B型(203 bp)和血清E型(363 bp);该方法敏感性高,对重组质粒标准品pMD-A、pMD-B和pMD-E检测限分别为43.080、3.710和4.350 copies/μL,对阳性菌液最低检出限均为102 CFU细菌;其特异性强,仅对血清型(A、B、E)多杀性巴氏杆菌有特异性扩增条带,同时对其他病原体均无扩增条带;该方法重复性良好,批间与批内试验均一致;临床样本及人工模拟感染样本检测结果显示与病原分离鉴定符合率为100%。【结论】成功建立了一种可鉴定不同血清型的牛多杀性巴氏杆菌多重PCR检测方法。

关键词：牛巴氏杆菌病多杀性巴氏杆菌血清型多重PCR

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禽分枝杆菌对豚鼠的致病性分析

微生物学通报 2022年第12期49卷 5277-5286页

作者：辛凌翔徐磊靳继惠任小侠朱良全程君生李俊平王团结王楠中国兽医药品监察所北京100081

【背景】我国禽型结核菌素(avian tuberculin)的制造用菌株为CVCC 68201、CVCC 68202和CVCC 68203株,但目前仍未明确这3株菌的生物学特性及对豚鼠致病性的情况。【目的】探究禽分枝杆菌(Mycobacteriumavium)的生物学特性及对动物机体的... 详细信息

【背景】我国禽型结核菌素(avian tuberculin)的制造用菌株为CVCC 68201、CVCC 68202和CVCC 68203株,但目前仍未明确这3株菌的生物学特性及对豚鼠致病性的情况。【目的】探究禽分枝杆菌(Mycobacteriumavium)的生物学特性及对动物机体的致病性,为禽结核病和牛结核病的防控工作提供技术支撑。【方法】对3株禽分枝杆菌基因组进行鉴定分析及核酸相似度分析;用3株禽分枝杆菌分别感染豚鼠,观察感染后的临床症状、病理学变化、体重增重情况分析、皮内变态反应结果、脏器系数变化等,进而分析3株禽分枝杆菌对豚鼠的致病力。【结果】种型鉴定和进化分析结果表明,CVCC 68201、CVCC 68202和CVCC 68203均为禽分枝杆菌,基因组与Mycobacterium avium *** FDAARGOS_1608最为相近;在感染前期、中期、后期对3株禽分枝杆菌感染豚鼠的体重增重情况分析发现,感染禽分枝杆菌影响豚鼠增重,主要表现为生长迟缓,感染第5周时,CVCC 68201、CVCC 68202组豚鼠的平均体重明显轻于未感染组;皮内变态反应试验结果显示,感染CVCC68201组豚鼠的皮肤红肿面积明显大于其他2个感染组,CVCC68201可引起机体更为强烈的迟发型变态反应;3株禽分枝杆菌感染后,豚鼠脾脏和肺脏存在不同程度的肿大与出血,其中感染CVCC68201豚鼠的肺脏系数与未感染组相比差异显著(P<0.01);病理学观察结果显示,豚鼠肺脏可见不同程度病变,其中CVCC 68201组更为严重,表现为肿大和轻微出血。各感染组豚鼠肺脏和脾脏组织切片抗酸染色均可见红色的分枝杆菌散在浸润。【结论】3株禽分枝杆菌对豚鼠均有一定程度的致病性,可引发局部病变。本研究为禽分枝杆菌的制备和鉴定提供依据,也为牛结核病的鉴别诊断方法研究提供参考。

关键词：禽分枝杆菌禽结核菌素牛结核病豚鼠致病性

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禽结核菌素生产用菌种的制备与鉴定

畜牧与兽医 2023年第4期55卷 102-106页

作者：王楠辛凌翔徐磊程君生王团结任小侠毛开荣李俊平中国兽医药品监察所北京100081

为制备禽结核菌素国家标准品,研究禽结核菌素生产用菌株禽分枝杆菌的菌种特性,对1992年冻干保存的3株菌CVCC68201、CVCC68202和CVCC68203进行复苏,采用SPF鸡复壮,分离培养后冻干了新批次菌种,对菌种形态、生化特性、培养特性、毒力和抗... 详细信息

为制备禽结核菌素国家标准品,研究禽结核菌素生产用菌株禽分枝杆菌的菌种特性,对1992年冻干保存的3株菌CVCC68201、CVCC68202和CVCC68203进行复苏,采用SPF鸡复壮,分离培养后冻干了新批次菌种,对菌种形态、生化特性、培养特性、毒力和抗原性进行了鉴定。结果表明,制备的菌种纯粹,形态、生化和培养特性符合禽分枝杆菌的生物学特征,免疫原性符合的兽用生物制品质量标准的规定。本研究为禽分枝杆菌的鉴定提供参考,也为制造禽结核菌素的工艺改进奠定基础。

关键词：禽分枝杆菌禽结核菌素鉴定

B型副鸡禽杆菌田间分离株的毒力及免疫原性研究

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中国兽医杂志 2022年第1期58卷 1-4,9页

作者：王秀丽于永于雷李旭妮蒋玉文辛凌翔张媛李俊平中国兽医药品监察所北京海淀100081 南京农业大学江苏南京210095 北京中海生物科技有限公司北京海淀100081

为探索分离自安徽省某大型白羽鸡场的1株B型副鸡禽杆菌的毒力及免疫原性,本试验测定了该菌对5~6胚龄SPF鸡胚及35~40日龄SPF鸡的毒力,并用该菌株制备免疫原,免疫35~40日龄SPF鸡,用攻毒的方法测定菌株的免疫原性,同时对本菌株制备的抗原... 详细信息

为探索分离自安徽省某大型白羽鸡场的1株B型副鸡禽杆菌的毒力及免疫原性,本试验测定了该菌对5~6胚龄SPF鸡胚及35~40日龄SPF鸡的毒力,并用该菌株制备免疫原,免疫35~40日龄SPF鸡,用攻毒的方法测定菌株的免疫原性,同时对本菌株制备的抗原及目前国内、国外市场上销售的鸡传染性鼻炎A型、B型、C型三价或二价灭活疫苗的免疫效力进行比较。毒力试验结果显示,本菌株对SPF鸡胚的最小致死剂量为110 CFU,对SPF鸡的最小发病剂量为5.5×10^(3) CFU。免疫原性试验结果显示,本菌株制备的抗原免疫鸡能有效抵抗本菌株的攻击,说明本菌株的免疫原性良好,而市场上销售的鸡传染性鼻炎三价/二价灭活疫苗免疫鸡均无法抵抗本菌株的攻击,说明市场上销售的疫苗对本菌株的保护效果较差,B型菌疫苗间的交叉保护效果不理想。本试验为B型鸡传染性鼻炎疫苗的研究提供参考和物质基础。

关键词：副鸡禽杆菌毒力免疫原性疫苗