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咖啡叶枯病病原鉴定、生物学特性及化学药剂筛选研究

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植物病理学报 2023年

作者：范艳妮贺春萍吴伟怀梁艳琼易克贤陆英海南大学植物保护学院中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/农业农村部热带农业绿色低碳重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室/海南省热带作物病虫害生物防治工程技术研究中心

咖啡叶枯病成为制约咖啡产量的重要病害之一。通过采集咖啡叶枯病典型病叶，病原分离、科赫氏法则验证、形态学观察及ITS、EF1-α、β-tublin多基因序列分析明确其病原菌为Diaporthetulliensis(塔利间座壳菌)。生物学特性表明菌株生长... 详细信息

咖啡叶枯病成为制约咖啡产量的重要病害之一。通过采集咖啡叶枯病典型病叶，病原分离、科赫氏法则验证、形态学观察及ITS、EF1-α、β-tublin多基因序列分析明确其病原菌为Diaporthetulliensis(塔利间座壳菌)。生物学特性表明菌株生长最适温度范围为25～30℃，致死温度为55℃，最适pH值为6，黑暗条件对菌丝生长更为有利，最佳碳源为麦芽糖，最佳氮源为硝酸钾。室内毒力测定结果表明97.2%咪鲜胺和50%咪鲜胺锰盐的抑菌作用最强，EC50值分别为0.0680、0.0696mg·L-1;95%苯醚甲环唑、80%多菌灵、97.3%戊唑醇、50%嘧菌酯抑菌作用次之，EC50值分别为0.1923、0.2360、0.7630和0.8731 mg·L-1。后续田间防治试验可优先考虑咪鲜胺及咪鲜胺锰盐作为主要防治药剂。本试验结果可为咖啡叶枯病防治提供数据依据。

关键词：咖啡叶枯病塔利间座壳菌多基因序列分析生物学特性室内毒力测定

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微生物代谢调控策略研究进展

热带农业工程 2022年第6期46卷 134-139页

作者：吴贺贺春萍云南农业大学农学与生物技术学院云南昆明650201 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海南海口571101

微生物正常生长发育过程依赖于细胞内相互交联、配合形成的复杂代谢网络,其中有些通路会产生对人类有益的多种代谢产物,但多数产物生成量少且无法满足高需求,通过修饰改造微生物功能基因可提高目的产物的效率。本文就改变微生物代谢效... 详细信息

微生物正常生长发育过程依赖于细胞内相互交联、配合形成的复杂代谢网络,其中有些通路会产生对人类有益的多种代谢产物,但多数产物生成量少且无法满足高需求,通过修饰改造微生物功能基因可提高目的产物的效率。本文就改变微生物代谢效率所用的代谢工程技术手段,包括微生物通路分析与遗传改造、菌株共培养调控策略、基于计算机预测的新型蛋白质工程以及与生物元件介导的动态调控策略等方面研究进行综述,并提出研究展望,以期为微生物代谢调控相关的研究提供参考。

关键词：代谢工程微生物动态调控发酵代谢产物

中粒种咖啡新发砖红镰刀叶枯病病原菌鉴定及其病原生物学分析

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热带作物学报 2022年第11期43卷 2345-2355页

作者：王倩吴伟怀贺春萍梁艳琼陆英易克贤海南大学植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室海南海口570228 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室海南海口571101

针对引起海南省白沙农场中粒种咖啡成株叶片呈砖红色枯萎症状的一种未知病害的病原菌进行分离,分离得到菌株21BS02-1和21BS02-2。将分离菌株接种到叶片并观察症状,发现菌株21BS02-1的发病症状与田间症状一致,通过再分离获得的菌株发病... 详细信息

针对引起海南省白沙农场中粒种咖啡成株叶片呈砖红色枯萎症状的一种未知病害的病原菌进行分离,分离得到菌株21BS02-1和21BS02-2。将分离菌株接种到叶片并观察症状,发现菌株21BS02-1的发病症状与田间症状一致,通过再分离获得的菌株发病症状也与初始病原菌症状一致,由此确定菌株21BS02-1即为致病菌。菌株21BS02-1的菌落主要呈白色,毡状,菌丝致密,菌落中央呈玫瑰色;其菌丝体细长,部分菌丝为有隔菌丝;大型分生孢子两端稍弯曲,形状似镰刀,其大小为(56.26~175.76)μm×(12.93~19.78)μm,有3~7个分隔;小型分生孢子较少,呈椭圆形,0~1个分隔;根据形态特征初步鉴定该病原菌为镰刀菌(Fusarium sp.)。进一步对菌株21BS02-1的ITS、β-tubulin、TEF基因序列进行克隆测序,经Blast搜索表明,其ITS、β-tubulin、TEF序列与Fusarium lateritium的同源性分别达到99.56%(MN686293)、100%(KJ00154)、99.68%(KF918550)。3个单基因聚类树均一致,表明菌株21BS02-1属于砖红镰刀菌(F. lateritium)。生物学特性测定表明,致病菌21BS02-1最适合的培养基为OMA和CMA培养基;碳源为蔗糖时的利用率最高;牛肉浸膏为致病菌最适生长的氮源;12 h光暗交替条件下菌丝生长最快;pH在7~9范围内最适合该致病菌生长。本研究是砖红镰刀菌(F. lateritium)侵染中粒种咖啡较为详细的报道。

关键词：咖啡叶枯病病原鉴定砖红镰刀菌

稻瘟菌T—DNA插入的突变表型分析和插入位点定位

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稻瘟菌T—DNA插入的突变表型分析和插入位点定位

作者：贺春萍华南热带农业大学

学位级别：硕士

稻瘟菌(Magnaporthe grisea,无性世代为Pyricularia oryzae)引起的稻瘟病是水稻最严重的真菌病害之一,每年给水稻生产带来重大的经济损失。稻瘟菌与水稻的互作符合基因对基因关系,现已被作为模式系统用于研究病原微生物-植物寄主的互作... 详细信息

稻瘟菌(Magnaporthe grisea,无性世代为Pyricularia oryzae)引起的稻瘟病是水稻最严重的真菌病害之一,每年给水稻生产带来重大的经济损失。稻瘟菌与水稻的互作符合基因对基因关系,现已被作为模式系统用于研究病原微生物-植物寄主的互作机理。稻瘟菌致病分子机制的研究不仅为病害的防治奠定理论基础,也为其它植物病原真菌的研究提供借鉴。本研究利用农杆菌介导的遗传转化体系构建稻瘟菌的T-DNA插入突变体库,使突变体数增加到6855个,每转化1.0x10～6个分生孢子可得到约300个T-DNA插入突变体。抽取最早构建的1600个突变体分别接种在感瘟病水稻品种日本晴和抗瘟病品种C101(对照)上,以测定其致病力的变化,同时对其形态学进行观察分析。结果得到173个菌落形态、分生孢子产生能力或附着胞发育等不正常的突变体。这173个突变体中,有23个对日本晴的致病力从原来的正常下降到完全不能致病,26个致病力明显减弱。从173个突变体中随机选取28个,进一步开展形态发育观察,结果发现15个颜色异常,7个菌落生长缓慢,2个分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞。用标准菌株1528和P131检测这28个突变体有性世代的形成能力,结果发现,Y34-0211、Y34-1469和Y34-0635三个突变体完全丧失产生有性世代的能力,其余参试突变体的有性世代形成能力保持不变。对这28个突变体的基因组进行了PCR扩增,结果从所有参试基因组中都能扩增到潮霉素磷酸转移酶基因(hph)序列,表明突变体的基因组中确实已经携带hph基因序列。用T-DNA左边界系列设计3个嵌套引物和AD9作为随机引物,以28个突变体基因组DNA作为模板,进行TAIL-PCR扩增。结果从6个突变体的基因组上扩增到T-DNA插入位点左侧的DNA片段。对这些左侧序列测序并与稻瘟菌基因组进行比对,获得如下T-DNA插入位点附近的序列资料: T-DNA在Y34-0635和Y34-0528-2基因组上的插入位点相同。该位点位于Ⅲ号染色体重叠群2.973上的53458bp处,其下游约1.0kb处有一个推测的蛋白编码基因MG05254.4。T-DNA的插入可能使上游调控序列不能发挥正常的作用而导致MG05254.4基因无法正常表达,其表型效应是对日本晴的致病力显著减弱(Y34-0635突变体)或完全丧失(Y34-0528-2突变体)。 T-DNA在Y34-0121和Y34-0588基因组上的插入位点都是在稻瘟菌Ⅱ号染色体重叠群2.387上的54377bp处,该插入位点刚好是在末知蛋白MG02065.4和MG02064.4编码基因之间。其表型效应只是分生孢子产孢量略有变化(Y34-0121和Y34-0588突变体)和附着胞形成能力显著降低(Y34-0121突变体)。因此推测T-DNA

关键词：稻瘟病菌 T-DNA插入突变侧翼序列功能基因组学

枯草芽孢杆菌Czk1脂肽物质对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制效果研究

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中国农业科技导报 2023年第6期25卷 126-134页

作者：贺春萍樊兰艳吴贺梁艳琼吴伟怀李锐郑服丛中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室海南省热带作物病虫害生物防治工程技术研究中心海口571101 海南大学植物保护学院海口570228 云南农业大学农学与生物技术学院昆明650201

白粉病和炭疽病是影响天然橡胶生产的重要病害。为明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czk1脂肽物质对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制作用,以橡胶种苗‘热研7-33-97’为试验材料,通过共培养法研究菌株Czk1脂肽粗提物对橡胶树炭疽病菌(Coll... 详细信息

白粉病和炭疽病是影响天然橡胶生产的重要病害。为明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Czk1脂肽物质对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制作用,以橡胶种苗‘热研7-33-97’为试验材料,通过共培养法研究菌株Czk1脂肽粗提物对橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)生长发育的影响,并采用脂肽粗提物和孢悬液法进行离体和盆栽试验评价其对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制作用。结果表明,Czk1脂肽类粗提物可导致橡胶树炭疽病菌菌丝畸形和断裂,抑制病菌的最低质量浓度为40 mg·L^(-1),抑制其分生孢子萌发EC_(50)值为3.80 mg·L^(-1);40 mg·L^(-1)的Czk1脂肽类粗提物对橡胶树炭疽病菌孢子萌发抑制率达68.84%。脂肽粗提物质量浓度在1000 mg·L^(-1)时,可使盆栽和离体试验中炭疽病发病率降低43.40%和49.90%,同时亦使白粉病病情指数降低32.60和21.60,对橡胶树白粉病的防治效果为45.60%。由此表明,菌株Czk1脂肽物质能有效降低橡胶树炭疽病和白粉病发病率、抑制病菌生长并延缓病情的扩展,具有防治橡胶树叶部病害的良好生防潜力。

关键词：枯草芽孢杆菌脂肽类化合物橡胶树炭疽病橡胶树白粉病抑菌作用

海南稻作区稻瘟病菌AvrPik等位基因的变异监测与多样性分析

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植物保护 2023年第2期49卷 57-64页

作者：危艺可王倩吴伟怀陆英贺春萍梁艳琼易克贤海南大学植物保护学院热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室海口570228 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室海口571101

海南省地处热带。由于具有国内其他地区无可比拟的光温资源优势,每年有大量的水稻材料在南繁区繁育与种植,给稻瘟病菌的变异及传播带来了极大的便利。自20世纪70年代以来,Pik等位基因已被广泛地用作水稻抗稻瘟病育种的主要抗源。为了解... 详细信息

海南省地处热带。由于具有国内其他地区无可比拟的光温资源优势,每年有大量的水稻材料在南繁区繁育与种植,给稻瘟病菌的变异及传播带来了极大的便利。自20世纪70年代以来,Pik等位基因已被广泛地用作水稻抗稻瘟病育种的主要抗源。为了解海南稻瘟病菌AvrPik等位基因的变异及多样性,本研究从海南稻作区采集穗茎瘟病样,通过单孢分离获得100株稻瘟病菌株。利用AvrPik基因特异性引物扩增病原菌DNA,所得PCR产物经克隆、测序后与参考序列进行比对分析。结果从100株菌株中鉴定出AvrPik_A、AvrPik_B、AvrPik_D、AvrPik_E和AvrPik_F共5种等位基因类型。其中AvrPik_D类型最多,出现频率为50.00%;其次为AvrPik_E类型,出现频率为32.08%;第三为AvrPik_B类型,出现频率为8.49%。在AvrPik等位基因核苷酸多样性方面,非信号肽区域多样性要明显高于信号肽区域。就群体受到的选择压而言,南繁种植区与常规种植区的稻瘟病菌群体的Ka/Ks值均大于1,分别为2.7031和1.2366,表明,无论是南繁区还是常规种植区,AvrPik等位基因均受到了强烈的正选择压,且南繁区群体受到的选择压更强。上述5种不同基因型的代表菌株中菌株20MG48(AvrPik_F)长势最快,其产孢量却最少。本研究初步明确了海南稻作区AvrPik等位基因的群体结构,为本稻作区抗性品种的布局以及抗瘟育种计划提供参考。

关键词：稻瘟病菌 AvrPik等位基因多样性

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一株热带土壤解磷细菌的筛选鉴定及拮抗初探

安徽农业科学 2009年第18期37卷 8347-8349,8405页

作者：王义余贤美贺春萍郑服丛海南大学环境与植物保护学院海南儋州571737 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海南儋州571737 农业部热带农林有害生物入侵检测与控制重点开放实验室海南儋州571737 海南省热带农业有害生物监测监控重点实验室海南儋州571737

[目的]研究热带土壤解磷微生物种群结构,筛选鉴定高效解磷菌株,为热带土壤解磷细菌的筛选和菌肥制备奠定基础。[方法]以有机磷液体培养基进行生物富集,无机磷固体培养基平板法从海南、广东、云南等地热带土壤中筛选出解磷效果较好的一... 详细信息

[目的]研究热带土壤解磷微生物种群结构,筛选鉴定高效解磷菌株,为热带土壤解磷细菌的筛选和菌肥制备奠定基础。[方法]以有机磷液体培养基进行生物富集,无机磷固体培养基平板法从海南、广东、云南等地热带土壤中筛选出解磷效果较好的一株解磷细菌PSB13。[结果]通过细菌16 S rRNA通用引物PCR扩增该菌株的16 S rDNA序列,测得序列长度为1 088 bp,经B lastn搜索进行序列比对,结果表明,该菌株属于Burkholderiasp。进一步的室内平板对峙培养试验表明,PSB13对Fusarium oxysporum piperis等11个供试病原菌中的9个具有不同程度的拮抗作用。[结论]PSB13是一株高效的具有开发前景的热带土壤解磷菌株。

关键词：热带土壤解磷细菌 16 S rDNA 分子鉴定拮抗

枯草芽孢杆菌CAS15嗜铁素基因dhbC的克隆、表达及功能鉴定

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生物工程学报 2009年第6期25卷 819-825页

作者：余贤美林超郑服丛贺春萍张修国山东农业大学植物保护学院泰安271018 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所儋州571737 海南大学环境与植物保护学院儋州571737

通过PCR技术扩增得到dhbC基因,对其进行序列分析发现,dhbC基因片段长为1197bp,预期编码398个氨基酸,蛋白分子量大小为43.8kD。将目的片段连接到表达载体pET-30a(+),转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET-30... 详细信息

通过PCR技术扩增得到dhbC基因,对其进行序列分析发现,dhbC基因片段长为1197bp,预期编码398个氨基酸,蛋白分子量大小为43.8kD。将目的片段连接到表达载体pET-30a(+),转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET-30a-dhbC,以IPTG在30oC诱导4h实现高效表达,获得一个分子量为48.8kD的融合蛋白。重组蛋白可溶性分析结果表明:融合蛋白主要为可溶性蛋白。Western blotting分析结果表明:重组蛋白可与兔抗His-tag多克隆抗体发生特异性反应,在48.8kD处有特异条带,与预期结果一致,证明重组质粒中含有dhbC基因。通过同源重组的策略将dhbC基因敲除后重新导入,验证了dhbC基因与嗜铁素的生物合成密切相关。

关键词：枯草芽孢杆菌 dhbC基因基因克隆序列分析原核表达基因敲除

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虹膜后粘连剥离术治疗继发性青光眼疗效观察

中国实用眼科杂志 2008年第8期26卷 816-817页

作者：李宇军车延华贺春萍黑龙江省医院道外院区眼科哈尔滨150056

目的探讨急性前葡萄膜炎出现瞳孔闭锁、膜闭继发性青光眼后，经各种药物治疗无效或效果不良时，实施虹膜后粘连剥离术的临床疗效。方法对7例7只眼急性前葡萄膜炎出现瞳孔闭锁、膜闭引起继发性青光眼患者，实行常规的前房穿刺术，用显微... 详细信息

目的探讨急性前葡萄膜炎出现瞳孔闭锁、膜闭继发性青光眼后，经各种药物治疗无效或效果不良时，实施虹膜后粘连剥离术的临床疗效。方法对7例7只眼急性前葡萄膜炎出现瞳孔闭锁、膜闭引起继发性青光眼患者，实行常规的前房穿刺术，用显微虹膜整复器或晶体调位钩经瞳孔缘进行虹膜后粘连剥离及机化膜剥离，前房置换液置换黏稠的前房水。结果术中一经剥开虹膜后粘连，膨隆的虹膜即时恢复平坦，10min后角膜水肿消失，眼球胀痛明显减轻或消失。术后检测眼压稳定在14．57～20．55mmHg（1mmHg=0．133kPa），视力明显改善。结论虹膜后粘连剥离术配合特殊的置换液是治疗虹膜睫状体炎继发青光眼新的有效的方法，可迅速解除高眼压持续状态，有效的保护了患者残存的视功能，明显抑制虹膜睫状体炎的炎性渗出，显著缩短了虹膜睫状体炎病程。

关键词：虹膜后粘连剥离术置换液继发青光眼