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尖孢镰刀菌西瓜专化型RPA检测方法的建立与评价

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南京农业大学学报 2024年第4期47卷 665-673页

作者：董文盼杨纪潇杨项明吕明慧朱彦泽蒋春号南京农业大学植物保护学院生物农药及绿色植保实验室江苏南京210095

[目的]构建了西瓜枯萎病菌——尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum ***,FON)的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)的快速检测体系,以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站... 详细信息

[目的]构建了西瓜枯萎病菌——尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum ***,FON)的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)的快速检测体系,以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站下载包括西瓜枯萎病菌在内的11种病原真菌的基因组序列,利用SeqHunter 2软件进行生物信息学分析,经比对得到4个FON的特异性基因片段,并对其进行引物设计和筛选。利用聚合酶链式反应(PCR)验证引物的特异性和灵敏度,然后利用建立的RPA检测体系对引物的特异性和灵敏度进行验证,最后进行人工接种FON的西瓜植株的RPA检测与评价。[结果]建立了FON的RPA检测体系,并对DNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系进行最佳反应时间(40 min)和最适反应温度(30℃)的摸索,得到其最佳反应体系的检测下限为100 pg·μL^(-1)。利用DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)进行扩增时,只需在38℃反应12 min,取50μL稀释20倍的扩增产物用胶体金试纸条进行检测,5 min后即可进行结果的判断,检测下限为100 pg·μL^(-1)。[结论]成功构建FON的RPA检测体系,且建立的RPA检测体系能够从温室接种FON之后未显症的西瓜植物组织基因组DNA中检测到FON,可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。

关键词：西瓜枯萎病尖孢镰刀菌西瓜专化型重组酶聚合酶扩增技术(RPA) 快速检测

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M60家族肽酶参与调控蜡质芽胞杆菌AR156防治南方根结线虫病的作用机制

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微生物学通报 2019年第1期46卷 84-92页

作者：廖梦婕汪宏凯蒋春号郭坚华南京农业大学植物保护学院江苏南京210095 南京农业大学农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室江苏南京210095

【背景】南方根结线虫(Meloidogyne incognita)寄主范围广泛,能侵染茄科、豆科、葫芦科等蔬菜,对世界农业生产造成了严重危害,每年造成的损失可高达数百亿美元。蜡质芽胞杆菌(Bacillus cereus) AR156是一种革兰氏阳性杆状细菌,对于南方... 详细信息

【背景】南方根结线虫(Meloidogyne incognita)寄主范围广泛,能侵染茄科、豆科、葫芦科等蔬菜,对世界农业生产造成了严重危害,每年造成的损失可高达数百亿美元。蜡质芽胞杆菌(Bacillus cereus) AR156是一种革兰氏阳性杆状细菌,对于南方根结线虫引起的土传病害有较好的防治效果,并且已经完成了全基因组测序。【目的】了解AR156对南方根结线虫的生防机理,寻找与生防功能相关的基因,进行遗传功能基因的分析。【方法】构建蜡质芽胞杆菌AR156 miniTn10随机插入突变体文库,通过对南方根结线虫致死率和温室防病试验进行筛选,找到与AR156生防能力相关的突变体,鉴定相关功能基因,并对产蛋白酶活性、定殖能力、生物膜形成和游动性等方面进行检测。【结果】与AR156野生型相比,转座子插入位点在M60家族肽酶的突变体BC41产蛋白酶活性下降,植物根围定殖能力减弱,生物膜形成能力和游动性受到影响,从而导致其防治南方根结线虫的能力降低。【结论】通过对生防相关功能基因的分析,初步明确M60家族肽酶在蜡质芽胞杆菌AR156防治南方根结线虫的过程中发挥重要作用。

关键词：蜡质芽胞杆菌南方根结线虫 M60家族肽酶定殖能力生物膜游动性

转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽孢杆菌AR156诱导系统抗性过程的作用机理研究

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转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽孢杆菌AR156诱导系统抗性过...

高效防治半夏软腐病生防菌的筛选及其生物防治效果研究

中国植物病理学会2016年学术年会

作者：蒋春号郭坚华南京农业大学植物保护学院

研究发现,根围有益微生物通过同时激活植物体内水杨酸、茉莉酸/乙烯两条信号通路能够更有效的帮助植物体抵抗广谱性的抗性,但是为什么蜡质芽孢杆菌AR156能同时激活拟南芥体内这两条信号通路,而其他生防因子如荧光假单胞菌、部分芽孢杆... 详细信息

研究发现,根围有益微生物通过同时激活植物体内水杨酸、茉莉酸/乙烯两条信号通路能够更有效的帮助植物体抵抗广谱性的抗性,但是为什么蜡质芽孢杆菌AR156能同时激活拟南芥体内这两条信号通路,而其他生防因子如荧光假单胞菌、部分芽孢杆菌只能激活其中的某一条信号途径。在本研究中,我们以拟南芥为模式植物探寻转录因子WRKY70和WRKY11在蜡质芽孢杆菌AR156诱导系统抗性过程中所起作用。结果表明,蜡质芽孢杆菌AR156处理拟南芥后,能够显著提升植物体内转录因子WRKY70的表达量,同时显著抑制WRKY11的表达。研究还发现转录因子WRKY70和WRKY1 1为蜡质芽孢杆菌AR156诱导细胞防卫反应以及防卫相关基因的表达所必须。过量表达转录因子WRKY70和WRKY1 1能够影响蜡质芽孢杆菌AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的抗性。突变体验证结果显示:蜡质芽孢杆菌AR156诱导抗性的能力在转录因子WRKY70和WRKY11单突变体拟南芥植株中能够保留,但抗性能力略微下降,然而在WRKY70和WRKY11双突变体植株中则完全丧失。以上结果表明,转录因子WRKY70和WRKY1 1是通过两条不同途径调控蜡质芽孢杆菌AR156诱导系统抗性的,并且这两条途径之间具有协调作用。转录因子WRKY70和WRKY11靶标分析结果表明:WRKY70通过水杨酸信号通路,WRKY11通过茉莉酸信号通路来调控蜡质芽孢杆菌AR156诱导的系统抗性,而且这两条调控通路之间具有NPR1的依赖性。综合上述结果,发现转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽孢杆菌AR156诱导系统抗性过程中起着重要的作用。本研究也是首次从转录因子角度出发,阐明根围有益微生物如何同时激活水杨酸、茉莉酸/乙烯两条信号通路,来诱导寄主植物对病原菌的抗性。

关键词：转录因子诱导系统抗病蜡质芽孢杆菌AR156 生物防治信号通路拟南芥

来源： cnki会议评论

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南京农业大学学报 2024年第6期47卷 1077-1085页

作者：张欣悦张华梦姚志鹏王莹陈雯蒋春号牛冬冬南京农业大学植物保护学院江苏南京210095

[目的]本研究旨在从实验室现有的生防细菌菌库中筛选对半夏软腐病具有较高防治效果的生防菌株,为半夏软腐病的绿色防控技术提供新的菌株资源。[方法]通过平板拮抗从实验室保存的300株具有生防潜力的菌株中,筛选对半夏软腐病具有拮抗效... 详细信息

[目的]本研究旨在从实验室现有的生防细菌菌库中筛选对半夏软腐病具有较高防治效果的生防菌株,为半夏软腐病的绿色防控技术提供新的菌株资源。[方法]通过平板拮抗从实验室保存的300株具有生防潜力的菌株中,筛选对半夏软腐病具有拮抗效果的菌株。进一步测定拮抗菌株的水解酶活性和透明圈半径,通过对抑菌圈和透明圈半径进行统计赋值得到对半夏软腐病较高防治效果的复筛菌株。通过离体及温室防效试验验证复筛菌株对半夏软腐病的防治效果。[结果]初筛得到20株对半夏软腐病具有生防潜力的菌株,测定抑菌圈、透明圈半径大小,按照统计结果对20株菌株进行赋值,结果显示5YN8、XZ231和7Ze3赋值分数最高,分别为11.0、11.0和10.5。经离体防效验证得到20株初筛菌株对半夏软腐病腐烂程度的不同影响,对比赋值大小及半夏块茎的腐烂程度发现建立的赋值体系与菌株的生防效果具有较好的相关性,即赋值分数越高,半夏块茎的生防效果越好。将筛选得到的赋值分数最高的3株生防菌株5YN8、XZ231与7Ze3进行温室防效验证,发现它们对半夏软腐病防治效果分别为85.01%、79.55%和79.62%。通过16S rRNA基因测序比对发现5YN8为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis),XZ231和7Ze3均为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。[结论]5YN8、XZ231与7Ze3三株生防菌株能够有效防治半夏软腐病,具有潜在的应用价值。

关键词：半夏软腐病生防菌筛选菌种鉴定防治效果

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金银花根腐病的病原鉴定及生物防治研究

植物病理学报 2024年第5期54卷 1008-1019页

作者：代晓雪李晓涵姚志鹏蒋春号牛冬冬南京农业大学植物保护学院南京210095

为了查明引起金银花(Lonicera japonica)根腐病的病原,本研究从表现根腐病症状的金银花根系中分离病菌。经致病性测定,结合形态特征和分子生物学鉴定结果,确定引起金银花根腐病的病原菌为茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和变红镰刀菌(Fus... 详细信息

为了查明引起金银花(Lonicera japonica)根腐病的病原,本研究从表现根腐病症状的金银花根系中分离病菌。经致病性测定,结合形态特征和分子生物学鉴定结果,确定引起金银花根腐病的病原菌为茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和变红镰刀菌(Fusarium incarnatum),且这两种镰刀菌复合侵染时根腐病发生更严重。对这两种病原菌进行生物学特性分析,结果表明其菌丝生长最适温度均为28℃,在低于4℃和高于50℃条件下停止生长;***孢子萌发最适温度为28℃,***孢子萌发最适温度为25~28℃;二者对于pH值的变化不敏感,在pH值为5~11条件下均能生长;***适宜在12 h光照;12 h黑暗光周期条件下生长,而***适宜在全黑暗条件下生长;***和***菌丝生长的致死温度分别为50℃和55℃(处理10 min);孢子萌发的致死温度均为50℃(水浴10 min);两种病原菌最适生长碳源同为果胶,但最适生长氮源有差异,***为胰蛋白胨,对其它氮源的利用效率较低,而***为蛋白胨,且具有广谱碳、氮源适应性。进一步分离和筛选能抑制金银花根腐病菌的高效生防菌株,从发生根腐病的金银花田块采集健康植株周围土壤,通过菌株分离、平板对峙培养、酶活测定、温室促生防病试验最终筛选到2株能促进金银花生长并且能高效防治金银花根腐病的生防菌株。经鉴定BG1为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),其防效为59.41%,BS37为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),其防效为52.47%。研究结果为金银花根腐病的防治提供了十分有潜力的生防资源,具有实际应用价值。

关键词：金银花根腐病病原菌生物学特性生物防治

拮抗酵母菌挥发物单体对草莓灰霉病的防治效果

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食品科学 2018年第21期39卷 230-236页

作者：余伟宋玥佘仲露奚裕婷郭虹娜蒋春号肖红梅南京农业大学食品科技学院江苏南京210095 南京农业大学植物保护学院江苏南京210095

为研究葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)挥发物单体对草莓灰霉病的防治作用,研究了21种挥发物单体离体条件下对灰葡萄孢的抑制作用,以及活体条件下3-羟基己酸乙酯、癸酸乙酯、桂皮醛和辛酸乙酯对草莓果实灰霉病的防治作用。结... 详细信息

为研究葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)挥发物单体对草莓灰霉病的防治作用,研究了21种挥发物单体离体条件下对灰葡萄孢的抑制作用,以及活体条件下3-羟基己酸乙酯、癸酸乙酯、桂皮醛和辛酸乙酯对草莓果实灰霉病的防治作用。结果表明:除月桂酸外,其余20种单体均对灰葡萄孢菌丝生长和孢子萌发有抑制作用,其中桂皮醛剂量为62.5μL/L时完全抑制菌丝生长,625μL/L时可以完全抑制孢子萌发;活体条件下,4种单体均能有效地抑制草莓果实采后灰霉病的发生,保持草莓色泽,延缓草莓可溶性固形物质量分数、可滴定酸质量分数、硬度等质构特性的下降,其中桂皮醛防治草莓灰霉病效果最好,具有商业开发前景。

关键词：挥发物单体桂皮醛草莓灰霉病果实品质

葡萄汁有孢汉逊酵母对采后草莓灰霉病抗性诱导机理研究

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园艺学报 2019年第7期46卷 1290-1302页

作者：窦国霞蒋春号郭虹娜刘佳贺沁玉肖红梅南京农业大学食品科技学院南京210095 南京农业大学植物保护学院南京210095

以采后‘红颜’草莓果实为试验材料,通过接种葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、先接种H. uvarum后挑战接种B. cinerea来探究H. uvarum对草莓采后灰霉病的生防效果及对草莓抗性诱导的相关机理。... 详细信息

以采后‘红颜’草莓果实为试验材料,通过接种葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、先接种H. uvarum后挑战接种B. cinerea来探究H. uvarum对草莓采后灰霉病的生防效果及对草莓抗性诱导的相关机理。结果显示,H. uvarum可短时间内在果实伤口部位定殖并大量繁殖,对草莓灰霉病有较好的防治效果,果实病斑直径显著减小。基因表达结果显示,先接种H. uvarum后挑战接种B. cinerea处理草莓果实的水杨酸(Salicylic acid)信号通路相关基因PR1、PR5、GLU、WRKY1、NPR1和PAL表达丰度在接种后12~24 h内显著上调,并高于H. uvarum和B. cinerea单独处理,但对茉莉酸(Jasmonic acid)信号通路标志基因PDF1和JAR1无影响;先接种H. uvarum后挑战接种B. cinerea处理可以短时间内提升草莓果实抗性相关酶SOD、APX、CAT和PAL的活性;接种H. uvarum可以延缓果实冷藏期间的劣变速度,维持较高的品质。

关键词：草莓灰霉病采后葡萄汁有孢汉逊酵母诱导抗病性水杨酸信号通路

贝莱斯芽胞杆菌5YN8生物被膜在防治番茄灰霉病过程中的功能研究

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中国生物防治学报 2022年第5期38卷 1223-1230页

作者：司方洁任金瑶黄涛祥俞仪阳郭坚华蒋春号南京农业大学植物保护学院南京210095

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起的番茄上重要的土传病害之一,危害番茄果实、叶、茎等部位,严重制约番茄的安全生产,微生物菌剂的施用被认为是防治该病害的有效措施。前期研究发现贝莱斯芽胞杆菌5YN8能够显著防治番茄灰霉... 详细信息

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌Botrytis cinerea引起的番茄上重要的土传病害之一,危害番茄果实、叶、茎等部位,严重制约番茄的安全生产,微生物菌剂的施用被认为是防治该病害的有效措施。前期研究发现贝莱斯芽胞杆菌5YN8能够显著防治番茄灰霉病,本研究通过构建相关基因突变体,探究生物被膜在5YN8防病过程中的作用,结果显示生物被膜增强突变体具有更致密的褶皱,而减弱突变体生物被膜光滑。进一步研究发现,菌株5YN8及其突变体处理14 d后,生物被膜减弱突变显著减少细菌在叶面的定殖,而增强突变则提升其定殖。另外,生物被膜减弱突变体防病效果显著降低,?spo0A对灰霉病防效仅为16.02%,而生物被膜增强突变体?abrB、?sinR防病效果显著增强,分别达80.77%、78.94%。相关性分析表明,5YN8的抑菌率、叶面定殖与其防效显著正相关。综合结果表明,5YN8生物被膜的形成依赖保守基因的调控,通过改变生防菌定殖及抑菌能力影响对番茄灰霉病防效。上述研究将为生防菌5YN8的功能修饰增强及在番茄灰霉病的应用提供理论基础。

关键词：番茄灰霉病贝莱斯芽胞杆菌生物防治生物被膜定殖

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植物根际促生枯草芽孢杆菌JC01筛选

微生物学通报 2016年第10期43卷 2187-2196页

作者：谢越盛许泉王大成王宁王超蒋春号郭坚华南京农业大学江苏南京210095 环境保护部南京环境科学研究所江苏南京210042 环境保护部有机食品发展中心江苏南京210042

【目的】筛选高效植物根际促生细菌,阐明产挥发性有机化合物(VOC)菌株JC01的促生机制。【方法】选取从植物根际中分离得到的838株细菌,以固氮、解(溶)磷以及分泌嗜铁素、吲哚乙酸(IAA)活性为指标,对其促生能力进行赋值评估,将赋值在3分... 详细信息

【目的】筛选高效植物根际促生细菌,阐明产挥发性有机化合物(VOC)菌株JC01的促生机制。【方法】选取从植物根际中分离得到的838株细菌,以固氮、解(溶)磷以及分泌嗜铁素、吲哚乙酸(IAA)活性为指标,对其促生能力进行赋值评估,将赋值在3分以上的107株细菌进行指纹图谱分析,挑选其中不同簇的20株促生潜力细菌进行温室实验,以评价赋值体系与温室促生效果之间的关系,进一步探究具有较好促生效果菌株JC01的作用机理。【结果】共筛选出了来源于指纹图谱中不同簇的4株具有较好促生效果的菌株,细菌的平板活性赋值与促生效果之间的相关系数r大于0.6。其中,菌株JC01分泌的具有促生作用的VOC能够增强番茄植株IAA信号通路关键基因的表达,减弱脱落酸(ABA)、乙烯(ETH)信号通路关键基因的表达。JC01经16S r RNA基因鉴定为枯草芽孢杆菌。【结论】细菌的平板活性赋值与促生效果之间存在较高的正相关性,枯草芽孢杆菌JC01可能通过产生VOC对番茄生长进行调控。

关键词：植物根际促生细菌(PGPR) 筛选赋值挥发性有机化合物促生信号通路