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切流式超滤技术及其在病毒学研究中的应用

中国兽医科技 1997年第6期27卷 42-43页

作者：王永录张永光方玉珍蒋守田中国农业科学院兰州兽医研究所

切流式超滤技术及其在病毒学研究中的应用王永录张永光方玉珍蒋守田（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）超滤（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）是借助于超滤膜或其他超滤装置对生物大分子物质进行分离、纯化及浓缩的一种技... 详细信息

切流式超滤技术及其在病毒学研究中的应用王永录张永光方玉珍蒋守田（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）超滤（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）是借助于超滤膜或其他超滤装置对生物大分子物质进行分离、纯化及浓缩的一种技术。这一技术以物理方法对大分子物质...

关键词：切流式超滤技术病毒学分离纯化

口蹄疫病毒泛亚型O／CHINA／99株全长cDNA分子克隆构建和感染性鉴定

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病毒学报 2009年第1期25卷 58-62页

作者：吕建亮张永光王永录潘丽刘力宽方玉珍蒋守田张维德中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利... 详细信息

设计并合成了O型口蹄疫泛亚型代表毒株O/CHINA/99基因组9条引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连到pOK-12载体上,经酶切、PCR和序列测定表明,O/CHINA/99全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的序列同源性为99.1%;利用T7 RNA聚合酶系统进行体外转录,转录产物RNA用脂质体转入BHK-21细胞传代培养,可观察到典型的FMDV致细胞病变效应;拯救病毒接种2日龄乳鼠后,可出现典型的临床症状,并于16～48h内死亡。以上结果表明,O/CHINA/99株全长cDNA分子克隆构建成功,并从构建的全长cDNA拯救出了口蹄疫病毒。

关键词：口蹄疫病毒全长cDNA 反向遗传学

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A型口蹄疫合成肽疫苗的免疫效力评价

微生物学报 2013年第6期53卷 596-607页

作者：唐华刘新生方玉珍蒋守田潘丽吕建亮张中旺周鹏张永光王永录中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046

【目的】研制A型口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)新型合成肽疫苗,为畜牧业减少经济损失。【方法】应用两种含有口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)AF/72株VP1[131-159]、VP4[20-35]、3A[21-35]和3B[29-42]4个抗原表位的合成肽联合CpG寡聚脱氧核苷酸(5'-TCGCGAACGTTCGCCCGATCGTCGGTA-3')在豚鼠上进行了免疫效力评价。【结果】2.5μg/只的合成肽364能保护4/5的豚鼠免受FMDV AF/72株的攻击,灭活苗组获得完全保护,其他组的保护效力仅为3/5;保护效力最高的两组的外周血CD4+T淋巴细胞含量高达33.7%和36.6%,而其他组不超过27.7%,PBS组仅为18.1%。【结论】本研究筛选出一组免疫效力较好的口蹄疫A型合成肽疫苗,可以作为候选疫苗进行进一步评价。

关键词：口蹄疫病毒合成肽体液免疫细胞免疫 CpG寡聚脱氧核苷酸 CD4+T淋巴细胞

不同保存条件对BHK-21细胞生长及其增殖口蹄疫病毒(FMDV)的影响

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中国兽医科技 1997年第10期27卷 22-23页

作者：方玉珍张永光王永录蒋守田况乾惕中国农业科学院兰州兽医研究所

不同保存条件对ＢＨＫ┐２１细胞生长及其增殖口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）的影响方玉珍张永光王永录蒋守田况乾惕（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６活的敏感细胞是病毒增殖的唯一场所，也是为病毒增殖提供能量和原材料的唯一载体... 详细信息

不同保存条件对ＢＨＫ┐２１细胞生长及其增殖口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）的影响方玉珍张永光王永录蒋守田况乾惕（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６活的敏感细胞是病毒增殖的唯一场所，也是为病毒增殖提供能量和原材料的唯一载体。因此，细胞培养技术作为组织培养的...

关键词：口蹄疫病毒 BHK-2 细胞生长病毒增殖

牛O-A型口蹄疫双价灭活苗研究——小白鼠接种疫苗后的细胞免疫应答

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中国兽医科技 1997年第1期27卷 5-7页

作者：王永录张永光方玉珍蒋守田况乾惕中国农业科学院兰州兽医研究所

用牛Ｏ型和Ａ型口蹄疫（ＦＭＤ）双价灭活苗免疫小白鼠后，通过四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）比色分析法检测了其病毒特异性Ｔ细胞增殖应答，相应抗原对免疫组淋巴结细胞的刺激增生作用高于未免疫对照组；通过氨基黑－１０Ｂ比色分析法检测... 详细信息

用牛Ｏ型和Ａ型口蹄疫（ＦＭＤ）双价灭活苗免疫小白鼠后，通过四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）比色分析法检测了其病毒特异性Ｔ细胞增殖应答，相应抗原对免疫组淋巴结细胞的刺激增生作用高于未免疫对照组；通过氨基黑－１０Ｂ比色分析法检测了其致敏淋巴细胞对靶细胞的杀伤率，免疫组为１４．３％～１５．５％，未免疫组为３．２％；通过常规毛细管法检测了白细胞移动指数（ＭＩ），免疫组为０．７５和０．７０，未免疫组为１．１３。以上３项检测结果经Ｆ检验，均达到１％的显著水平，表明小白鼠接种牛Ｏ型和Ａ型ＦＭＤ双价灭活苗后。

关键词：口蹄疫双价灭活苗细胞免疫

牛O型口蹄疫灭活苗制苗毒种的稳定性及其免疫原性监测

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中国兽医科技 1995年第4期25卷 5-8页

作者：张永光刘再新况乾惕方玉珍蒋守田魏怀录中国农业科学院兰州兽医研究所

用Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ法测定牛Ｏ型口蹄疫（ＦＭＤ）制苗毒种ＯＡ／５８（Ｆ４９／９１）对牛的半数最小感染量（ＭＩＤ＿（５０））为１０￣（－８．７７）／０．１ｍｌ，与ＯＡ／５８（Ｆ３０／６６）一致，表明毒种对一的毒力稳定。... 详细信息

用Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ法测定牛Ｏ型口蹄疫（ＦＭＤ）制苗毒种ＯＡ／５８（Ｆ４９／９１）对牛的半数最小感染量（ＭＩＤ＿（５０））为１０￣（－８．７７）／０．１ｍｌ，与ＯＡ／５８（Ｆ３０／６６）一致，表明毒种对一的毒力稳定。毒种适应制苗细胞ＢＨＫ—２１单层在７～２０代内收获的细胞毒具有稳定的蚀斑特性和感染性滴度。不同代数病毒（Ｆ１０、Ｆ１５、Ｆ２０）蚀斑克隆株的大斑、小斑株按疫苗制造与检验试行规程制成双相油佐剂疫苗免疫豚鼠，２８天后用强毒攻击，结呆Ｆ１０６／８保护，Ｆ１５６／８保护，Ｆ２０７／８保护，证明在试验代数内制苗毒种对豚鼠具有良好、稳定的免疫原性。对强毒攻击７天后的豚鼠血清中和抗体分析表明，此时血清中和效价与免疫豚鼠抗强毒感染的保护性之间无对应关系。

关键词：口蹄疫制苗毒种稳定性免疫原性监测疫苗

牛O型A型口蹄疫双价灭活疫苗研究──—A型毒种的选择

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中国兽医科技 1995年第12期25卷 6-9页

作者：张永光刘在新方玉珍蒋守田魏怀录王永录况乾惕中国农业科学院兰州兽医研究所

收集保藏的６株口蹄疫（ＦＭＤ）Ａ型牛源强毒，适应乳鼠５代，转适８ＨＫ—２１细胞单层１０代，用弗氏完全佐剂制成疫苗免疫豚鼠。综合分析其对实验动物及制苗细胞的适应性、病毒感染性滴度、豚鼠抗强毒攻击的免疫原性、血清中和抗体... 详细信息

收集保藏的６株口蹄疫（ＦＭＤ）Ａ型牛源强毒，适应乳鼠５代，转适８ＨＫ—２１细胞单层１０代，用弗氏完全佐剂制成疫苗免疫豚鼠。综合分析其对实验动物及制苗细胞的适应性、病毒感染性滴度、豚鼠抗强毒攻击的免疫原性、血清中和抗体应答的抗原广谱杜表明，在６株毒中ＡＦ／７２具有更好的适应性，病毒滴度高，免疫原性好，抗原谱广。

关键词：口蹄疫灭活疫苗疫苗 A型毒种选择

牛O-A型口蹄疫双价灭活苗研究——疫苗制备及其安全效力试验

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中国兽医科技 1996年第5期26卷 3-5页

作者：张永光王永录蒋守田方玉珍魏怀禄况乾惕中国农业科学院兰州兽医研究所 730046

选择的牛O和A型口蹄疫(FMD)制苗毒种,通过转瓶BHK-21细胞浓缩培养制备病毒。经二乙烯亚胺(BEI)不同浓度条件下灭活A型病毒的动力学测定,确定了灭活最低安全水平。用拟定配方和工艺制备的油佐剂O-A型双价灭活疫苗大剂量(10 ml)接种敏感... 详细信息

选择的牛O和A型口蹄疫(FMD)制苗毒种,通过转瓶BHK-21细胞浓缩培养制备病毒。经二乙烯亚胺(BEI)不同浓度条件下灭活A型病毒的动力学测定,确定了灭活最低安全水平。用拟定配方和工艺制备的油佐剂O-A型双价灭活疫苗大剂量(10 ml)接种敏感小公牛安全无害。4 ml剂量接种牛,于免疫后30 d用10000 ID_(50)同源强毒攻击,结果O型8/9保护,A型8/8保护。所有疫苗接种牛对2个病毒型均有良好的抗体应答,O型血清中和滴度达1:20(1.31)的接种牛抗强毒攻击获得保护超过了88%,高于1:20未获得保护的不足12%;A型血清中和滴度达1:76(1.88)的接种牛抗强毒攻击100%获得保护。

关键词：口蹄疫双价灭活疫苗安全效力试验牛病

A型口蹄疫病毒多抗原表位杆状病毒表达载体的构建及表达

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中国兽医科学 2014年第9期44卷 881-886页

作者：李登科刘新生方玉珍潘丽吕建亮张中旺周鹏蒋守田张永光王永录中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

为构建A型口蹄疫病毒(FMDV)多抗原表位杆状病毒表达载体,将A型FMDV上5个B细胞表位(VP1140-160aa、VP270-80aa、VP352-67aa、3B29-42aa和3D16-30aa)和4个辅助性T细胞表位(VP1200-213aa、VP420-34aa、3A21-35aa和3D346-370aa)通过人工合成的方法串联起来构建复合多表位基因B。然后将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB。将酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒pFastBac HTB-B转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将PCR鉴定正确的重组杆状病毒质粒利用CellfectinⅡReagent转染至Sf9细胞。通过间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况。结果显示,能够得到与A型FMDV猪抗阳性血清结合的蛋白,大小约为22.3ku,与预期结果相符。结果表明,成功构建了A型FMDV多抗原表位杆状病毒表达载体,并在昆虫细胞中正确表达,为下一步蛋白纯化奠定了基础。

关键词： A型口蹄疫病毒多抗原表位 Sf9细胞表达