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类弹性蛋白多肽的制备及其自组装成微球载溶菌酶

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类弹性蛋白多肽的制备及其自组装成微球载溶菌酶

作者：葛慧华华侨大学

学位级别：硕士

类弹性蛋白多肽由于具有特殊的相变性质、加之有优良生物相容性、可在体内进行自然降解成氨基酸、无毒、且可通过基因工程进行高通量生产等优势，已成为生物医药材料领域的热点，在组织工程及药物载体上具有广泛应用前景。本文利用自行... 详细信息

类弹性蛋白多肽由于具有特殊的相变性质、加之有优良生物相容性、可在体内进行自然降解成氨基酸、无毒、且可通过基因工程进行高通量生产等优势，已成为生物医药材料领域的热点，在组织工程及药物载体上具有广泛应用前景。本文利用自行设计的新型类弹性蛋白多肽[KV8F]n，研究了其制备、自组装成微球的影响因素及作用机制以及将其用于溶菌酶的包埋等研究，所得结果如下：首先，采用谷氨酰胺来确定氨基酸初始添加浓度，分析了各种氨基酸对类弹性蛋白多肽[KV8F]40产量的影响。结果表明，苏氨酸、精氨酸和半胱氨酸能较大提高产量，其中苏氨酸最为明显，产量可达126.9mg/L，比对照82.4mg/L增加了54%;利用响应面设计对上述三种氨基酸进行了3因素3水平实验，经优化后所得理论最大产量为100.3mg/L，经实验验证，所得实验值为103.1mg/L，与理论值吻合。但其产量低于单个氨基酸，经交互作用分析表明，三种对产量有促进作用的氨基酸之间无互作或者存在拮抗作用，如苏氨酸和半胱氨酸。其次，以类弹性蛋白多肽[KV8F]n为对象，利用动态光散射仪测定了不同条件下其自组装成微球的粒径。结果表明：随着分子量的增加ELPs形成的微球粒径也随之增大，粒径的均一度减小;当盐浓度低于0.4mol/L时，盐浓度的增加，微球粒径相应增加，而盐浓度高于0.4mol/L则呈减少的趋势，但粒径均大于1.1μm;而当ELPs末端融合木聚糖酶和1,3-丙二醇氧化还原酶后，其自组装形成的微球粒径急剧减小，约为游离ELPs的1/10，分别为151.0nm和174.2nm。导致这种现象的原因可能是酶分子和ELPs通过静电引力相互作用后，酶分子的空间位阻妨碍了ELPs分子的聚集。最后，用纯化的ELP140包埋溶菌酶，测定不同条件下的包埋率，探索最适条件;同时，测定纯ELPs的粒径和包埋溶菌酶后的ELPs的粒径并推测其包埋的形式。结果表明：在ELP140浓度为30μmol/L时，其包埋率达到最高，可达23.24%，且当ELPs与溶菌酶之比越高，包埋率越高;利用马尔文动态光散射仪扫描结果表明包埋前后ELPs的粒径并无明显的变化，推测自组装形成微球时，溶菌酶被包埋在微球内部。

关键词：类弹性蛋白多肽响应面分析自组装空间位阻溶菌酶

嗜冷嗜酸β-1,4-木聚糖酶及其钙离子依赖型碳水化合物结合模块

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微生物学报 2023年第8期63卷 3252-3263页

作者：葛慧华刘婷杨纯张光亚华侨大学生物工程与技术系福建厦门361021

【目的】β-1,4-木聚糖酶是木聚糖降解的关键酶之一,嗜冷嗜酸木聚糖酶在功能性低聚木糖的制备中具有重要作用,但相关报道较少。【方法】从太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica)菌株WPAGA1基因组发掘到一条新型的木聚糖酶序列,经基因... 详细信息

【目的】β-1,4-木聚糖酶是木聚糖降解的关键酶之一,嗜冷嗜酸木聚糖酶在功能性低聚木糖的制备中具有重要作用,但相关报道较少。【方法】从太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica)菌株WPAGA1基因组发掘到一条新型的木聚糖酶序列,经基因合成、质粒构建和表达,并对其进行分离纯化及酶学性质研究。【结果】该木聚糖酶(Xyl4513)具有2个保守结构域,一个属于糖苷水解酶11家族(glycoside hydrolase family 11,GH11)催化模块(Xyl4513-T),另一个属于碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)60家族(CBM4513),这是一种非常罕见的GH11家族木聚糖酶含有CBM的现象。纯化后的Xyl4513最适反应温度和pH值分别为30℃、3.0,这一特性说明Xyl4513为嗜冷嗜酸β-1,4-木聚糖酶;而截短的木聚糖酶Xyl4513-T最适反应温度和pH值分别为20℃、4.0,且催化效率(kcat/Km)较前者下降了20%,说明CBM4513对酶稳定性和催化效率有较大影响。Ca^(2+)、Mg2+和Ni2+对酶催化活性均有明显促进作用,其中Ca^(2+)效果更为明显。仅当含有Ca^(2+)时,CBM4513才对β-1,4-木聚糖具有特异性结合能力,属于Ca^(2+)依赖型CBM,其最大结合量为9.13μmol/g。【结论】本文获得了一种新型的嗜冷嗜酸木聚糖酶和相应的Ca^(2+)依赖型CBM,进一步丰富了它们的基因和蛋白资源。

关键词：木聚糖酶 Ca^(2+)依赖型碳水化合物结合模块(CBM) 嗜冷嗜酸酶低聚木糖

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酸性和碱性酶模式识别的研究

计算机与应用化学 2012年第11期29卷 1363-1366页

作者：葛慧华张光亚华侨大学生物工程与技术系福建厦门361021

了解酸性和碱性酶稳定性机理及在此基础上建立基于序列的模式识别方法对探讨其构效关系及酶的改造具有重要意义。本文采用主成分分析、偏最小二乘回归和BP神经网络3种方法对酸性和碱性酶进行模式识别。结果表明,基于主成分分析和偏最小... 详细信息

了解酸性和碱性酶稳定性机理及在此基础上建立基于序列的模式识别方法对探讨其构效关系及酶的改造具有重要意义。本文采用主成分分析、偏最小二乘回归和BP神经网络3种方法对酸性和碱性酶进行模式识别。结果表明,基于主成分分析和偏最小二乘回归建立的线性方程能有效解释酸性和碱性酶稳定性机制,3种方法对训练集拟合的平均正确率分别为73.2%、87.0%和98.0%,建立了1种基于数学模型解释酶适应不同pH的分子机制及识别酸性和碱性酶的新方法。

关键词：模式识别酸性酶碱性酶线性回归 BP神经网络

影响类弹性蛋白多肽自组装成微球的因素及其作用机制

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生物工程学报 2014年第8期30卷 1274-1282页

作者：葛慧华王文研张光亚王士斌华侨大学生物工程与技术系福建厦门361021

影响类弹性蛋白多肽(ELPs)自组装成微球的因素较多,目前尚缺乏系统研究。以类弹性蛋白多肽[KV8F]n为对象,利用动态光散射仪测定了不同条件下其自组装成微球的粒径。结果表明:随着分子量的增加ELPs形成的微球粒径也随之增大,粒径的均一... 详细信息

影响类弹性蛋白多肽(ELPs)自组装成微球的因素较多,目前尚缺乏系统研究。以类弹性蛋白多肽[KV8F]n为对象,利用动态光散射仪测定了不同条件下其自组装成微球的粒径。结果表明:随着分子量的增加ELPs形成的微球粒径也随之增大,粒径的均一度减小;当盐浓度低于0.4 mol/L时,盐浓度的增加,微球粒径相应增加,而盐浓度高于0.4 mol/L则呈减少的趋势,但粒径均大于1.1μm;而当ELPs末端融合木聚糖酶和1,3-丙二醇氧化还原酶后,其自组装形成的微球粒径急剧减小,约为游离ELPs的1/10,分别为151.0 nm和174.2 nm。导致这种现象的原因可能是酶分子和ELPs通过静电引力相互作用后,酶分子的空间位阻妨碍了ELPs分子的聚集。

关键词：类弹性蛋白多肽静电引力空间位阻自组装融合蛋白

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氨基酸对类弹性蛋白多肽产量的影响

华侨大学学报（自然科学版） 2013年第5期34卷 542-546页

作者：葛慧华张光亚王士斌华侨大学化工学院福建厦门362021

采用谷氨酰胺来确定氨基酸初始添加浓度,分析各种氨基酸对类弹性蛋白多肽[KV8F-40]产量的影响.结果表明:苏氨酸、精氨酸和半胱氨酸都能较大提高产量,其中以苏氨酸最为明显,产量可达126.9mg·L-1,比对照增加54.0%.利用响应面设计对上述3... 详细信息

采用谷氨酰胺来确定氨基酸初始添加浓度,分析各种氨基酸对类弹性蛋白多肽[KV8F-40]产量的影响.结果表明:苏氨酸、精氨酸和半胱氨酸都能较大提高产量,其中以苏氨酸最为明显,产量可达126.9mg·L-1,比对照增加54.0%.利用响应面设计对上述3种氨基酸进行3因素3水平实验,经优化后所得理论最大产量为100.3mg·L-1.经实验验证,所得实验值为103.1mg·L-1,与理论值吻合,但其产量低于单个氨基酸.交互作用分析表明:3种对产量有促进作用的氨基酸之间没有互作或者存在拮抗作用.

关键词：类弹性蛋白多肽条件优化氨基酸响应面设计

以类弹性蛋白多肽为标签纯化1,3-丙二醇氧化还原酶

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应用与环境生物学报 2013年第4期19卷 709-712页

作者：葛慧华黄志宏王文研张诗冉张光亚华侨大学生物工程与技术系厦门361021

以类弹性蛋白多肽(ELPs)为标签的非色谱纯化重组蛋白显示出良好的应用前景.本文使用自行设计的新型ELPs纯化标签,以低浓度盐诱发其可逆相变,从而更温和、高效地纯化融合表达的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR).在测得ELPs-PDOR融合蛋白在不... 详细信息

以类弹性蛋白多肽(ELPs)为标签的非色谱纯化重组蛋白显示出良好的应用前景.本文使用自行设计的新型ELPs纯化标签,以低浓度盐诱发其可逆相变,从而更温和、高效地纯化融合表达的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR).在测得ELPs-PDOR融合蛋白在不同浓度Na2CO3溶液中相变温度的基础上,选取0.8 mol/L Na2CO3溶液,在室温下使ELPs发生可逆相变,与目的蛋白PDOR一同聚集,经可逆相变以离心法得以纯化,得到纯度约98%的纯酶,纯化倍数可达到8倍以上,是组氨酸标签的7倍多.融合酶的酶学性质表明ELPs作为纯化标签对目标蛋白空间结构影响微小,融合蛋白可直接作为酶催化化学反应.低盐诱发相变的方法,可避免盐浓度过高对酶结构及性能产生的不利影响,因此,在重组酶纯化上更具有优势.

关键词：类弹性蛋白多肽纯化标签可逆相变重组酶纯化非色谱法

酶及寡聚化结构域影响类弹性蛋白多肽相变的规律及机制

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应用与环境生物学报 2020年第6期26卷 1534-1539页

作者：葛慧华王心哲邱岳张光亚华侨大学化工学院生物工程与技术系厦门361021

了解外源酶对类弹性蛋白多肽(ELPs)相变温度及聚集所形成颗粒粒径大小及分布的规律,有助于高效利用非色谱纯化技术实现目标酶分离纯化,也为选择孔径合适的分离膜构建酶膜反应器提供依据.以ELPs40、寡聚化ELPs40(E-F)、寡聚化及线性的地... 详细信息

了解外源酶对类弹性蛋白多肽(ELPs)相变温度及聚集所形成颗粒粒径大小及分布的规律,有助于高效利用非色谱纯化技术实现目标酶分离纯化,也为选择孔径合适的分离膜构建酶膜反应器提供依据.以ELPs40、寡聚化ELPs40(E-F)、寡聚化及线性的地衣多糖酶(B-E-F、B-E)和木聚糖酶(X-E-F、X-E)为研究对象,考察外源酶对ELPs40相变温度的影响.结果显示,引入地衣多糖酶及木聚糖酶分别将ELPs的相变温度提高了11℃和13℃;而寡聚化结构域Foldon却使B-E-F及X-E-F相变温度分别降低了8℃和11℃.此外,探究了NaCl、Na2SO4及Na2CO3对上述融合蛋白中ELPs相变温度的影响.结果显示,B-E-F在0.1-0.3 mol/L Na2CO3溶液中未发生相变,而在等浓度的Na2SO4溶液中则发生了明显相变,这一现象明显不符合Hofmeister离子序,这可能与地衣多糖酶和Foldon较低的等电点有关.

关键词：蛋白寡聚化相变温度类弹性蛋白多肽重组蛋白纯化 Hofmeister离子序

铁蛋白介导的地衣多糖酶胞内自发聚集及其高效制备

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生物工程学报 2022年第4期38卷 1602-1611页

作者：葛慧华葛钟琪毛磊张光亚华侨大学生物工程与技术系福建厦门361021

酶分离纯化、固定化及催化性能提升一直是生物催化领域的研究热点和前沿,也是众多研究者致力解决的难点。研究和开发新型的纯化、固定化及提升催化性能的方法,降低纯化及储存等设备的要求及生产成本,对酶大规模应用具有重要意义。文中... 详细信息

酶分离纯化、固定化及催化性能提升一直是生物催化领域的研究热点和前沿,也是众多研究者致力解决的难点。研究和开发新型的纯化、固定化及提升催化性能的方法,降低纯化及储存等设备的要求及生产成本,对酶大规模应用具有重要意义。文中将铁蛋白(ferritin)与目标酶(地衣多糖酶)基因融合,经高效表达后,在细胞内自发形成无载体固定化酶,且可经低速离心分离纯化,纯度可达90%以上,酶活回收率为61.1%,在30℃储存608 h后,依然能够保持活力,且比初始时活力略有增加。在重复使用10次以后,仍保持初始酶活力的50.0%。该微米级固定化酶可自发复溶,形成直径约为12 nm的可溶寡聚地衣多糖酶,其比活力是游离地衣多糖酶的12.48倍,催化效率则是后者的7.11倍,在50℃时,酶活性降低为初始值一半所需时间也延长了11.09倍。这表明铁蛋白有望成为一种全新的分离纯化目标酶并大幅提升其催化性能的标签。

关键词：铁蛋白无载体自固定化酶寡聚化生物分离酶活性聚集体生物催化

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以序列特征值预测酶和非酶蛋白及内含肽

计算机与应用化学 2010年第4期27卷 435-438页

作者：葛慧华罗靖张光亚华侨大学生物工程与技术系福建厦门361021

利用生物信息学快速准确鉴别酶、非酶蛋白及内含肽能极大提高实验效率,而测序数量的指数型增长使酶、非酶蛋白及内含肽的自动分类尤显重要。本文获取了同一性小于25%的序列共计3853条,采用Z标度的伪氨基酸组成和氨基酸组成分布提取序列... 详细信息

利用生物信息学快速准确鉴别酶、非酶蛋白及内含肽能极大提高实验效率,而测序数量的指数型增长使酶、非酶蛋白及内含肽的自动分类尤显重要。本文获取了同一性小于25%的序列共计3853条,采用Z标度的伪氨基酸组成和氨基酸组成分布提取序列特征值识别酶、非酶蛋白及内含肽。结果表明,该特征值提取方法经参数优化后,即当λ=5,w=0.15时,以支持向量机为分类器,其10倍交叉验证的精度可达81.3%,ROC曲线下面积为0.83;其精度高于其它方法0.5%到12.9%不等;独立样本测试的预测精度可达71.2%,ROC曲线下面积为0.782,其精度高于其它方法0.4%到6.4%不等,效果均优于其它常见的序列特征值方法。本文结果说明从序列出发判断其归属是可行的,3种不同功能的分子在序列特征上存在一定的差异,所建立的Z标度的伪氨基酸组成和氨基酸组成分布法可用于其它类似的生物信息学问题。建立了从序列出发预测酶、非酶蛋白及内含肽的新方法。

关键词：酶非酶蛋白内含肽伪氨基酸组成氨基酸组成分布