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莫西霉素高产菌株的构建

微生物学通报 2024年第9期51卷 3597-3613页

作者：祝青越王立军李栋范可强任晋玮曹广祥潘国辉山东第一医科大学(山东省医学科学院)生物医学科学学院(省医药生物技术研究中心) 山东济南250117 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101 中国科学院大学存济医学院北京101408 中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室北京100101

【背景】莫西霉素(kirromycin)是由山丘链霉菌(Streptomyces collinus)Tü365产生的一种复杂线性聚酮-非核糖体肽类化合物,可与细菌延伸因子EF-Tu相互作用,阻碍蛋白质合成,具有窄谱抑菌活性。目前莫西霉素作为实验试剂用于核糖体结构和... 详细信息

【背景】莫西霉素(kirromycin)是由山丘链霉菌(Streptomyces collinus)Tü365产生的一种复杂线性聚酮-非核糖体肽类化合物,可与细菌延伸因子EF-Tu相互作用,阻碍蛋白质合成,具有窄谱抑菌活性。目前莫西霉素作为实验试剂用于核糖体结构和功能研究。近年来有研究报道,莫西霉素及其类似物抗沃尔巴克氏体(Wolbachia)活性优于注册药物多西环素,有望成为治疗丝状线虫感染的新先导化合物。【目的】运用组合代谢工程方法,构建莫西霉素高产菌株,实现莫西霉素产量的提升。【方法】基于莫西霉素生物合成基因簇以及生物合成途径分析,利用组成型启动子kasOp*过表达或组合过表达莫西霉素生物合成基因簇内的巴豆酰辅酶A还原酶编码基因kirN、天冬氨酸-1-脱羧酶编码基因kirD、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶编码基因kirP、转运蛋白超家族外排泵编码基因kirTI和kirTII、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)中乙酰辅酶A羧化酶编码基因acc等,实现莫西霉素产量的提升。【结果】过表达/组合过表达上述基因对莫西霉素产量均有一定提升效果,其中,单独过表达acc及组合过表达kirD、kirN、kirP、kirTI和kirTII的效果更好,莫西霉素产量较野生型菌株分别提高了57.8%和65.6%,达到198.3 mg/L和208.1 mg/L。此外,通过在公开的细菌基因组数据库中搜索莫西霉素生物合成酶的同源蛋白编码基因,发现31个预测可以合成莫西霉素类天然产物的生物合成基因簇。【结论】本研究运用代谢工程方法有效提升了莫西霉素的产量,为进一步推动莫西霉素的应用开发奠定了基础。

关键词：次级代谢产物莫西霉素聚酮-非核糖体肽代谢工程产量提升

拟无枝酸菌属次级代谢潜能分析及代表菌株基因编辑体系建立

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微生物学通报 2024年第5期51卷 1713-1731页

作者：杨英哲范可强王海燕向丽军张书平赵燕潘国辉山东第一医科大学(山东省医学科学院)生物医学科学学院(省医药生物技术研究中心) 山东济南250117 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101 中国科学院大学存济医学院北京101408

【背景】拟无枝酸菌属作为一类重要的稀有放线菌,是抗菌、抗癌类药物的重要来源,其合成天然产物的潜能尚待系统分析及发掘。【目的】揭示拟无枝酸菌属不同结构类型次级代谢产物合成潜能,并建立两个代表性菌株的遗传操作体系,为结构新颖... 详细信息

【背景】拟无枝酸菌属作为一类重要的稀有放线菌,是抗菌、抗癌类药物的重要来源,其合成天然产物的潜能尚待系统分析及发掘。【目的】揭示拟无枝酸菌属不同结构类型次级代谢产物合成潜能,并建立两个代表性菌株的遗传操作体系,为结构新颖或生物活性优良的次级代谢产物发掘及研究提供条件。【方法】使用多位点序列分析(multi-locus sequence analysis,MLSA)方法评价已公布的拟无枝酸菌基因组之间的相似度。同时,使用antiSMASH分析所有基因组的基因簇,预测其合成产物结构信息,并利用BiG-SCAPE对基因簇进行聚类分析。利用pSET152整合载体优化两个代表性拟无枝酸菌的接合转移条件,以建立遗传操作体系。采用CRISPR-cBEST碱基编辑和传统的同源重组确定靶基因失活方案。【结果】146个拟无枝酸菌基因组的生物信息学分析显示,平均每个基因组中含有33个基因簇。其中聚肽、聚酮及萜类合成基因簇的丰度较高,并且大多数基因簇与已知化合物基因簇不同。成功确定了拟无枝酸菌属两个代表菌株的最适接合转移条件。尽管CRISPR基因编辑质粒能够转入拟无枝酸菌,但6个载体均未成功编辑目标基因,而利用传统同源重组方法则成功敲除目标基因,建立了目的基因敲除系统。【结论】次级代谢潜能分析显示拟无枝酸菌属中蕴含丰富的新颖天然产物资源。此外,成功建立的基因编辑体系实现了外源基因整合及内源基因敲除,为该属新颖次级代谢产物的挖掘及生物合成研究提供了坚实的研究基础。

关键词：拟无枝酸菌属次级代谢天然产物生物合成基因簇基因编辑

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龟裂霉素新产生菌株的鉴定及其产量优化

微生物学通报 2024年第8期51卷 3133-3147页

作者：曹浩榄王立军冯颖赢马博洋范可强王立艳夏焕章潘国辉沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁本溪117004 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101 中国科学院大学存济医学院北京100049 山东第一医科大学(山东省医学科学院)生物医学科学学院(省医药生物技术研究中心) 山东济南250117 中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院北京100083

【背景】龟裂霉素(rimocidin)是一种具有广谱抗真菌活性的四烯大环内酯类化合物,对多种真菌性植物病害具有较强的防治作用,因此具有开发成农用抗生素药物的潜力。目前已经陆续发现几株链霉菌可以生产龟裂霉素,如龟裂链霉菌(Streptomyces... 详细信息

【背景】龟裂霉素(rimocidin)是一种具有广谱抗真菌活性的四烯大环内酯类化合物,对多种真菌性植物病害具有较强的防治作用,因此具有开发成农用抗生素药物的潜力。目前已经陆续发现几株链霉菌可以生产龟裂霉素,如龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)M527,但是龟裂霉素的低产量仍限制其在农用抗生素方面的开发。【目的】系统揭示链霉菌基因组中龟裂霉素生物合成基因簇(rim基因簇)的分布及特征,发现新的龟裂霉素生产菌株,并基于基因工程等策略提高其产量。【方法】采用BLASTp在链霉菌基因组中搜索龟裂霉素已知生物合成酶的同源蛋白,进一步筛选出预测可合成龟裂霉素的基因簇及所在菌株。使用多位点序列分析方法(multi-locus sequence analysis,MLSA)评价含有龟裂霉素生物合成基因簇的菌株的进化关系。基于代谢产物分析鉴定新的龟裂霉素生产菌株,并通过筛选发酵培养基和过表达调控蛋白RimoR2来提高龟裂霉素的产量。【结果】共发掘获得36个新的含有龟裂霉素生物合成基因簇的链霉菌菌株。并通过培养基筛选、发酵及代谢产物分析等证实其中的白色链霉菌(Streptomyces albofaciens)JCM 4342能够合成龟裂霉素及其类似物CE-108。经过培养基优化的龟裂霉素产量为172.5 mg/L。此外,过表达调控蛋白RimoR2后龟裂霉素的产量较出发菌株提高了2.3倍,达到397.1 mg/L。【结论】本研究系统分析了链霉菌中龟裂霉素生物合成基因簇及其所在菌株的分布特点,并通过实验证实其中的*** JCM 4342能够合成龟裂霉素及其类似物CE-108。此外,通过基因工程方法实现了龟裂霉素产量的提高。本研究为构建更优的龟裂霉素高产菌株提供了新的元件、菌株和理论基础,将有助于推动龟裂霉素的进一步应用开发研究。

关键词：次级代谢产物龟裂霉素抗真菌链霉菌产量提高

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喷他霉素新生产菌的发现及产量提高

微生物学通报 2024年第8期51卷 2888-2904页

作者：孙佳宁王海燕范可强何信廖振翔王立艳黄英任晋玮孟大利潘国辉沈阳药科大学中药学院辽宁沈阳110016 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101 中国科学院大学北京101408 中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院北京100083 中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室北京100101

【背景】喷他霉素(pentamycin)是一种多烯大环内酯类抗生素,对白色念珠菌(Candida albicans)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和其他几种病原菌有显著的抑制活性,在瑞士已被注册用于治疗阴道念珠菌病、滴虫病和混合感染。【目的】... 详细信息

【背景】喷他霉素(pentamycin)是一种多烯大环内酯类抗生素,对白色念珠菌(Candida albicans)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和其他几种病原菌有显著的抑制活性,在瑞士已被注册用于治疗阴道念珠菌病、滴虫病和混合感染。【目的】发掘新的喷他霉素生物合成基因簇及其生产菌株,并通过基因工程改造方法提高其产量,为进一步提高喷他霉素产量、推动其工业化生产应用提供新思路及理论基础。【方法】通过BLASTp分析从细菌基因组中搜索喷他霉素已知生物合成酶的同源蛋白,进一步筛选出可能合成喷他霉素及其类似物filipin的新基因簇,使用多位点序列分析(multi-locus sequence analysis,MLSA)方法比较其所在宿主菌株的基因组相似性。利用组成型启动子kasOp*过表达LuxR家族转录调控基因ptnF以提高喷他霉素的产量。【结果】从细菌基因组中发掘获得了27个新的含有喷他霉素/filipin生物合成基因簇的菌株。并通过培养基筛选、发酵及代谢产物分析等证实了其中的米修链霉菌(Streptomyces misionensis)能够合成喷他霉素、filipin III等一系列化合物。进一步通过基因工程方法将喷他霉素的产量较野生菌株提高了4.34倍,达到101.7 mg/L,并且喷他霉素及filipin类似物总量达到146.1 mg/L,较野生菌株提高了3.28倍。【结论】本研究系统分析了细菌基因组中喷他霉素类天然产物生物合成基因簇及其所在菌株的多样性,通过实验证实其中的米修链霉菌能够合成喷他霉素及filipin类天然产物。此外,通过基因工程改造实现了喷他霉素产量的提高。本研究为构建更优的喷他霉素工业化生产菌株提供了新的元件、途径、菌株及理论基础。

关键词：次级代谢产物喷他霉素生物合成基因簇基因工程改造

高浓度底物下青霉素扩环酶的活性评价与底物抑制现象

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生物工程学报 2015年第12期31卷 1690-1699页

作者：伍林军范可强季俊杰杨克迁中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101 中国科学院大学北京100049

本文对青霉素扩环酶(Penicillin expandase,也称Deacetoxycephalosporin C synthase,DAOCS)在高浓度青霉素G下的底物抑制现象进行初步评价与表征,筛选适合工业应用条件的高活力突变体。我们通过HPLC对已报道的几个DAOCS高活力突变体在... 详细信息

本文对青霉素扩环酶(Penicillin expandase,也称Deacetoxycephalosporin C synthase,DAOCS)在高浓度青霉素G下的底物抑制现象进行初步评价与表征,筛选适合工业应用条件的高活力突变体。我们通过HPLC对已报道的几个DAOCS高活力突变体在青霉素G浓度5.6至500 mmol/L间的比活力进行定量测定,并与不同催化反应动力学模型的理论推测变化趋势比较,发现DAOCS野生型酶及高活力突变体H4、H5、H6与H7在高浓度青霉素G条件下均表现出明显的底物抑制现象,但是变化趋势不同。野生型酶与突变体H4的比活力先上升后下降,与竞争性抑制模型预测不符。突变体H5、H6与H7的比活力变化呈现更复杂的变化趋势。在所有测试的突变体中,H6的活性显著高于其他突变体酶。青霉素G对野生型DAOCS的底物抑制现象符合非竞争性抑制模型的预测。而部分突变体表现出复杂的底物抑制行为,表明其具有更复杂的作用机制。在高底物浓度下筛选具有较强催化活性的青霉素扩环酶突变体对于推动其在工业生产中的应用具有重要指导作用。

关键词：去乙酰氧头孢菌素C合成酶底物抑制高浓度青霉素G

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利用重氧水合成同位素标记化合物的方法

大学化学 1999年第4期14卷 56-58,22页

作者：范可强北京大学化学学院

本文试对利用羧酸衍生物和亚胺的水解反应和同位素交换反应引入标记Ｏ１８的方法进行一个概要性的介绍。

关键词：重氧水同位素标记氧18标记化合物合成

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杨克迁研究员的链霉菌研究历程

微生物学报 2017年第7期57卷 1138-1139页

作者：王为善范可强陈义华李子龙

杨克迁,男,博士,研究员,1964年12月9日生于北京,2017年3月21日卒于北京。杨克迁研究员出生在一个知识分子家庭,自小受到良好的教育。1981年以优异的成绩考取中国海洋大学生物系。1985年以全系第一的成绩考取国家公派留学资格,在四川外... 详细信息

杨克迁,男,博士,研究员,1964年12月9日生于北京,2017年3月21日卒于北京。杨克迁研究员出生在一个知识分子家庭,自小受到良好的教育。1981年以优异的成绩考取中国海洋大学生物系。1985年以全系第一的成绩考取国家公派留学资格,在四川外国语学院和北京外国语学院培训两年后,赴加拿大达尔豪斯大学生物系攻读博士学位,1993年获博士学位。

关键词：研究员链霉菌中国海洋大学博士学位知识分子生物系北京加拿大

芳香聚酮早期后修饰环化酶的结构分类和功能分析

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微生物学报 2010年第5期50卷 561-567页

作者：张霞范可强李红玉杨克迁兰州大学生命科学学院兰州730000 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101

聚酮是一类结构和生物活性多样的天然产物,根据结构特点可以分为芳香聚酮和复合聚酮两大类。芳香聚酮环化酶是芳香聚酮生物合成过程中一种非常重要的早期后修饰酶,是决定芳香聚酮骨架结构的主要影响因素。根据序列和结构的相似性,芳香... 详细信息

聚酮是一类结构和生物活性多样的天然产物,根据结构特点可以分为芳香聚酮和复合聚酮两大类。芳香聚酮环化酶是芳香聚酮生物合成过程中一种非常重要的早期后修饰酶,是决定芳香聚酮骨架结构的主要影响因素。根据序列和结构的相似性,芳香聚酮环化酶可以分为不同的种类。本文主要对其中3类芳香聚酮环化酶结构和功能进行了简要总结,从晶体结构、催化反应和催化机制等方面对它们进行了分类描述和功能分析,并结合自己实验室工作介绍了杰多霉素B环化酶催化机制的研究方法。

关键词：聚酮后修饰酶环化/芳化酶晶体结构催化机制

中国夏季月际—季节平均降水动力和统计结合实时预测模型

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大气科学 2024年第1期48卷 359-375页

作者：范可田宝强戴海霞中山大学大气科学学院/南方海洋科学与工程广东省实验室(珠海) 珠海519082 中国科学院大气物理研究所竺可桢—南森国际研究中心北京100029 南京信息工程大学气象灾害预报预警与评估协同创新中心南京210044 国防科技大学气象海洋学院长沙410073

中国夏季降水大幅度月际尺度变化往往造成极端旱涝事件交替或转折,但其月际异常会被季节平均掩盖,影响季节尺度气候预测准确度,因此亟需考虑月际气候预测,提升月际—季节尺度气候预测准确度。本文首先采用年际增量和场信息耦合型预测方... 详细信息

中国夏季降水大幅度月际尺度变化往往造成极端旱涝事件交替或转折,但其月际异常会被季节平均掩盖,影响季节尺度气候预测准确度,因此亟需考虑月际气候预测,提升月际—季节尺度气候预测准确度。本文首先采用年际增量和场信息耦合型预测方法研制中国夏季6~8月月际尺度降水动力和统计结合气候预测模型,之后根据月际尺度降水预测,开展季节平均降水预测。首先,基于前期观测信息和美国第二代气候预测系统(CFSv2)预测结果,选取前期12月观测的南太平洋中高纬关键区海温、1月北极关键区海冰密集度以及CFSv2预测系统2月起报的夏季同期关键区海温作为月际尺度降水预测因子,分别研制以上具有物理意义的单预测因子预测模型,并采用奇异值分解(SVD)误差订正方法对其改进;之后,利用多因子择优集合方案,研制预测效能较高且稳定的中国160站夏季月际尺度降水动力和统计结合预测模型,进而基于月际尺度预测开展夏季季节平均气候预测。1983~2022年夏季(6~8月)中国160站逐月降水预测模型的交叉检验结果表明:逐月回报与观测降水距平百分率的时间相关系数通过90%置信水平的站点占比分别为90%,88%,82%,多年平均的空间相关系数分别为0.39、0.40和0.39,均通过99%置信水平。针对2020~2022年连续三年同样拉尼娜背景下但不同中国夏季降水形势,开展月际—季节独立回报检验,其结果显示,2020~2022年6、7、8月预测降水距平百分率的趋势异常综合检验(PS)平均分分别为75、75和70分;夏季季节平均降水的PS评分分别为72、76和73分,均高于多年业务预测平均分。由此,考虑月际异常开展季节尺度气候预测是提升月际—季节尺度气候预测准确度的一个有效途径。

关键词：中国夏季月际—季节尺度动力和统计结合降水预测 SVD误差订正择优集合方案实时预测

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