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S基因显性阴性突变体干扰乙肝病毒颗粒组装的研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第2期24卷 88-91页

作者：邸雅南胡大荣胡学玲李娟范公忍吴忆贫北京军区总医院肝病研究所北京100700

目的　探讨S基因突变对HBV病毒颗粒组装的影响。方法　构建野生型S基因、S基因突变的真核表达载体pcDNA3 S和pcDNA3 mS及S基因突变的全长HBV基因组表达载体pHBV mS ,用pHBV mS与pcDNA3 S共转染HepG2细胞 ,pHBV mS与pcDNA3共转染HepG2细... 详细信息

目的　探讨S基因突变对HBV病毒颗粒组装的影响。方法　构建野生型S基因、S基因突变的真核表达载体pcDNA3 S和pcDNA3 mS及S基因突变的全长HBV基因组表达载体pHBV mS ,用pHBV mS与pcDNA3 S共转染HepG2细胞 ,pHBV mS与pcDNA3共转染HepG2细胞 ,以adwR9与pcDNA3共转染为对照 ;pcDNA3 mS和adwR9共转染HepG2细胞 ,以adwR9和pcDNA3共转染为对照 ,用荧光定量PCR检测胞内和上清中病毒量 ,用ELISA方法检测上清中S抗原。结果　pHBV mS与pcDNA3共转染组上清中病毒量较对照组低而胞内病毒量二者相同。pHBV mS与pcDNA3 S共转染组上清、胞内病毒量与对照组相同。pcDNA3 mS和adwR9共转染HepG2细胞其上清中病毒量较对照组低而胞内病毒量两者相同。上清中S抗原实验组较对照组低。结论　S突变体干扰HBV病毒颗粒的组装 ,导致的HBV病毒颗粒分泌下降。

关键词：乙型肝炎病毒S基因基因突变真核表达载体 ELISA 乙肝病毒颗粒慢性肝病

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丙型肝炎病毒结构蛋白抗原表位的研究进展

中华肝脏病杂志 1999年第S1期7卷 73-75页

作者：汪毅范公忍胡大荣北京军区总医院肝病研究所 100700

基因重组HBV联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV作用及HBV包装细胞系的构建

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中华肝脏病杂志 2002年第4期10卷 260-265页

作者：孙殿兴胡大荣邬光惠胡学玲 100700 李娟范公忍北京军区总医院肝病研究所 100700

目的探讨HBV作为基因治疗载体的可能性并检验其联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV的作用。方法在表达完整HBV颗粒的质粒上,经基因修饰后联合表达S区反义RNA和核心-P蛋白的融合蛋白,整合于具有HBV复制的2.2.15细胞,形成细胞克隆,EL... 详细信息

目的探讨HBV作为基因治疗载体的可能性并检验其联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV的作用。方法在表达完整HBV颗粒的质粒上,经基因修饰后联合表达S区反义RNA和核心-P蛋白的融合蛋白,整合于具有HBV复制的2.2.15细胞,形成细胞克隆,ELISA 法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。HBV全基因经删除包装信号ε区后,插入到G418抗性PCI-neo载体,转染HepG2细胞系,用G418筛选形成细胞克隆,检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系,进一步转染表达复制缺损型HBV的质粒,经两种抗生素同时筛选,PCR方法观察上清液中的病毒。结果 2.2.15-pMEP4组、2.2.15-CP组、2.2.15-SAS组和2.2.15-CPAS组,对HBsAg平均抑制率分别为2.74％±3.83％、40.08％±2.05％（t=35.5,P<0.01）、66.54％±4.45％（t=42.3,P<0.01）和73.68％±5.07％（t=51.9,P<0.01）;对HBeAg平均抑制率分别为4.46％±4.25％、52.86％±1.32％（t=36.2,P<0.01）、26.36％±1.69％（t=22.3,P<0.01）和 59.28％±2.10％（t=39.0,P<0.01）;对 HBV复制的抑制率分别为0、82.0％、59.9％和96.6％。在各治疗组培养上清液中均能检测出重组HBV颗粒。证明包装细胞系具有HBSAg和HBcAg表达。

关键词：基因重组 HBV 反义RNA 显性阴性突变体包装细胞系基因治疗

分子杂交化学发光法检测血清中乙型肝炎病毒DNA

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临床检验杂志 2002年第1期20卷 45-46页

作者：邬光惠范公忍张桂霞黄耀煊北京军区总医院肝病研究所北京100700

目的　用非放射性的异羟基洋地黄毒甙 (地高辛 ,Dig)标记探针与靶DNA杂交 ,结合化学发光检测系统检测乙肝患者血清中HBVDNA。方法　应用宝灵曼公司生产的DigDNA标记检测试剂盒。将Dig标记的HBVDNA探针与点印迹在尼龙膜或硝酸纤维素膜上... 详细信息

目的　用非放射性的异羟基洋地黄毒甙 (地高辛 ,Dig)标记探针与靶DNA杂交 ,结合化学发光检测系统检测乙肝患者血清中HBVDNA。方法　应用宝灵曼公司生产的DigDNA标记检测试剂盒。将Dig标记的HBVDNA探针与点印迹在尼龙膜或硝酸纤维素膜上的靶DNA杂交 ,杂交后的膜与Dig AP抗体保温 ,然后用化学发光底物CSPD与之作用 ,导致在波长 4 77nm处发光 ,感光于X光底片上。结果　待检的 12 9份血清标本 ,用此法检测HBVDNA阳性率达 5 8 4 % ,敏感性 2 0pg～0 5 pg。为了比较 ,3 2 9份血清标本用显色法测定 ,阳性率 4 5 0 % ,敏感性 5 0 pg～ 1 0 pg。对照组呈阴性结果。结论　Dig标记探针分子杂交化学发光法具有较高特异性、敏感性和简便等优点 ,可用于血清中HBVDNA的检测。

关键词：分子杂交化学发光检测乙型肝炎病毒血管诊断 HBV-DNA

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小鼠骨髓干细胞诱导分化为肝细胞的实验研究

中华肝脏病杂志 2004年第12期12卷 722-725页

作者：周一鸣胡大荣姚鹏范公忍北京军区总医院肝病研究所 100700

目的探讨成年小鼠骨髓干细胞在肝细胞生长因子(HGF)作用下分化为肝细胞的可能性及其分化特性,为肝细胞移植提供实验基础。方法 HGF 100 ng/ml体外诱导小鼠骨髓干细胞向肝细胞分化,于诱导的第0、7、14、21、28天,观察细胞形态特征;半... 详细信息

目的探讨成年小鼠骨髓干细胞在肝细胞生长因子(HGF)作用下分化为肝细胞的可能性及其分化特性,为肝细胞移植提供实验基础。方法 HGF 100 ng/ml体外诱导小鼠骨髓干细胞向肝细胞分化,于诱导的第0、7、14、21、28天,观察细胞形态特征;半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)mRNA水平的表达;免疫细胞化学法检测ALB、AFP和细胞角蛋白19(CK 19)蛋白水平的表达。结果新鲜分离的骨髓干细胞ALB及AFP mRNA呈弱阳性。在非诱导组,培养7 d时ALB mRNA已检测不到,AFP mRNA明显减弱,14 d时消失。在诱导组,7 d时ALB mRNA检测不到,14 d时再次出现阳性条带,21 d时表达量最大,而AFP mRNA在诱导组始终呈阳性,14 d时表达量最大,以后逐渐减少。免疫细胞化学结果与RT-PCR结果基本一致,但CK 19蛋白始终阴性。结论小鼠骨髓干细胞在HGF单独作用下能诱导分化为肝细胞样细胞,诱导分化的最佳时期是2-3周。

关键词：骨髓干细胞 ALB AFP 肝细胞诱导分化小鼠 HGF mRNA水平表达量 RT-PCR

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潮霉素抗性HBV包装细胞系的构建

中华实验和临床病毒学杂志 2004年第1期18卷 28-30页

作者：胡大荣孙殿兴熊锦华邬光惠胡学玲李娟范公忍韩聚强北京军区总医院全军肝病研究所 100700 白求恩国际和平医院肝病科

目的　配合HBV载体的研究 ,为HBV载体提供包装。方法　HBV全基因经删除包装信号ε区后 ,插入到潮霉素抗性pMEP4载体 ,转染HepG2 细胞系 ,用潮霉素筛选形成细胞克隆。检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系 ,进一步转染稳定表达... 详细信息

目的　配合HBV载体的研究 ,为HBV载体提供包装。方法　HBV全基因经删除包装信号ε区后 ,插入到潮霉素抗性pMEP4载体 ,转染HepG2 细胞系 ,用潮霉素筛选形成细胞克隆。检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系 ,进一步转染稳定表达复制缺损型HBV的质粒 ,PCR方法观察上清液中病毒的形成。结果　包装细胞系高表达HBsAg和HBcAg ;携带重组HBV的G4 18抗性重组逆转录病毒感染潮霉素抗性包装细胞系后 ,经两种抗生素同时筛选 ,在细胞培养上清液中能检出突变型HBV ,未检出野生型HBV。结论　删除了包装信号的HBV次全基因 ,失去了形成完整HBV颗粒的能力 ,但能为复制缺损型HBV提供包装所需的结构蛋白。

关键词：潮霉素 HBV 包装细胞系基因突变基因疗法乙型肝炎病毒抗性基因

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包膜蛋白突变对乙型肝炎病毒包装的影响

中华内科杂志 2005年第2期44卷 118-121页

作者：邸雅南胡大荣熊锦华胡学玲李娟范公忍吴忆贫北京军区总医院肝病研究所 100700

目的　探讨包膜蛋白突变对HBV包装的影响。方法　构建包膜蛋白突变的全长HBV基因组表达载体:前S1突变HBV表达载体pHBV mS1、Sloop突变HBV表达载体pHBV mS和前S1、S共突变HBV表达载体pHBV mS1S。分别转染HepG2细胞,以野生型HBV质粒 (adwR... 详细信息

目的　探讨包膜蛋白突变对HBV包装的影响。方法　构建包膜蛋白突变的全长HBV基因组表达载体:前S1突变HBV表达载体pHBV mS1、Sloop突变HBV表达载体pHBV mS和前S1、S共突变HBV表达载体pHBV mS1S。分别转染HepG2细胞,以野生型HBV质粒 (adwR9 )转染HepG2细胞为对照;pHBV mS1S和pcDNA3分别与adwR9共转染HepG2细胞。ELISA方法检测上清液中和胞内S抗原;荧光定量PCR检测胞内和上清液中病毒量。结果　突变体pHBV mS1、pHBV mS和pHBV mS1S与对照组adwR9中S蛋白表达量和分泌量无明显差别;单独转染的突变体胞内病毒量较adwR9高,尤其以pHBV mS1S明显,而突变体上清中病毒量较对照组adwR9低,尤其以pHBV mS1S明显;pHBV mS1S与adwR9共转染组上清液中病毒量较pcDNA3与adwR9共转染组低。结论包膜蛋白突变对S蛋白表达量和分泌量无影响,但影响病毒包装,使病毒分泌量下降。

关键词：包膜蛋白乙型肝炎病毒包装 HepG2细胞荧光定量PCR检测 pcDNA3 ELISA方法表达载体 HBV 病毒量共转染上清液突变体分泌量表达量 S蛋白对照组基因组野生型 S抗原胞内

丙型肝炎病毒核心蛋白在患者外周血单个核细胞内的核表达检测

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中华实验和临床病毒学杂志 2002年第1期16卷 37-39页

作者：陈良标陈佩兰范公忍李琳刘超英北京军区总医院解放军肝病研究所北京100700

目的　检测和研究丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus,HCV)核心蛋白在患者外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcells ,PBMC)内核表达的意义 ,并探讨其与临床的关系。方法　对 6 6例慢性丙型肝炎患者PBMC标本进行免疫组化检测 ,并... 详细信息

目的　检测和研究丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus,HCV)核心蛋白在患者外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcells ,PBMC)内核表达的意义 ,并探讨其与临床的关系。方法　对 6 6例慢性丙型肝炎患者PBMC标本进行免疫组化检测 ,并将HCV蛋白抗原定位分布情况与患者临床状况进行比较分析 ,对其中 2 7例患者PBMC进行HCVRNA和HCVAg的平行检测和分析。结果　免疫组化结果显示 ,慢性丙型肝炎患者PBMCHCVAg(core +NS3)阳性检出率为 77 2 7% (5 1 6 6 )。结果还证实 ,HCV核心蛋白均定位于胞核内 ,且呈强表达 ;NS3蛋白主要定位于胞质内 ,呈弱表达。当进行HCVAg在PBMC内定位情况与患者临床状况比较分析时显示 ,病情较重患者PBMC内核心蛋白表达阳性率 (35 2 9% )明显高于病情较轻者 (5 88% ) (P <0 0 0 1)。结论　HCV核心蛋白在PBMC内核表达与患者临床状况相关 ,提示其可能是丙型肝炎慢性化的一个指标。

关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白单核白细胞免疫组织化学

丙型肝炎病毒及乙型肝炎病毒联合基因免疫实验研究

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中华医学杂志 2002年第2期82卷 77-80页

作者：邓涛范公忍陈天宝陈乃玲胡大荣王孟薇贾克明解放军肝病研究所北京100700

目的　为HCV/HBV重叠或混合感染的防治寻求新的高效联合基因免疫策略。方法　分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于真核表达载体 (pRSC) ,构建pRSC HBV/HCV ,转染小鼠骨髓瘤细胞 (SP2 / 0 ) ,通过免疫荧光和Western印... 详细信息

目的　为HCV/HBV重叠或混合感染的防治寻求新的高效联合基因免疫策略。方法　分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于真核表达载体 (pRSC) ,构建pRSC HBV/HCV ,转染小鼠骨髓瘤细胞 (SP2 / 0 ) ,通过免疫荧光和Western印迹法检测蛋白的表达 ,免疫Balb/c小鼠 ,用酶联免疫法、乳酸脱氢酶释放法及荷瘤试验观察小鼠体液免疫应答及细胞免疫应答。结果　pRSC HBV/HCV转染的SP2 / 0细胞可见HBcAg及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞 ,相对分子质量 14 0 0 0及 2 10 0 0处均可见蛋白条带 ,Western印迹分析可见特异性的蛋白条带。 10只免疫鼠中全部出现抗 HCV及抗 HBV抗体 ,而对照组 (n =10 )全阴性。免疫组小鼠脾细胞对转染pRSC HBV/HCV的SP2 / 0细胞的细胞毒活性明显高于对照组 ,荷瘤试验显示免疫组小鼠注射转染pRSC HBV/HCV的SP2 / 0细胞后肿瘤生长缓慢。结论　pRSC

关键词： HBV HCV 转染联合基因小鼠 SP2/0细胞 RSC 蛋白免疫实验混合感染