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敲除核糖体蛋白L8对果蝇发育的阻滞与细胞凋亡紧密相关

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中国科学：生命科学 2010年第8期40卷 724-730页

作者：李红艳潘丽霞苟克勉中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室北京100193 清华大学医学院北京100080

核糖体蛋白L8是核糖体60S大亚基的一个组分,参与蛋白质合成.尽管L8蛋白参与果蝇的正常发育过程,但对其作用机理仍不清楚.为了探讨其相关分子机制,通过RNAi技术消除L8蛋白,同时从体内和体外探测其对果蝇发育的影响.结果发现,L8RNAi能导... 详细信息

核糖体蛋白L8是核糖体60S大亚基的一个组分,参与蛋白质合成.尽管L8蛋白参与果蝇的正常发育过程,但对其作用机理仍不清楚.为了探讨其相关分子机制,通过RNAi技术消除L8蛋白,同时从体内和体外探测其对果蝇发育的影响.结果发现,L8RNAi能导致胚胎或一期幼虫致死、幼虫发育迟缓、眼睛和翅膀形态严重缺陷,并且显著减少S2培养细胞的数目,表明L8对果蝇的发育起至关重要的作用.用吖啶橙对果蝇翅膀disc染色表明,L8消除后能引起明显的细胞凋亡发生.对一些细胞凋亡(p53,hid,reaper,Dark,Dcp-1)和细胞周期(cdc45,MCM3,cyclin B,incenp)调节因子的RT-PCR分析很好地支持了L8缺失造成的表型,而它们表达水平的变化和其在诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞中的作用一致.上述结果表明,L8的消除能严重损伤果蝇发育,此过程与细胞分化阻滞和细胞凋亡紧密相关,其间p53可能发挥了关键的作用.

关键词：核糖体蛋白L8 果蝇 RNAi 细胞凋亡细胞周期 p53

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绵羊胞内单精子注射技术

实验生物学报 2002年第2期35卷 103-108页

作者：苟克勉安晓荣田见辉陈永福中国农业大学农业生物技术国家重点实验室动物科技学院北京100094

本文的主要目标是建立绵羊胞内单精子注射技术(intracyioplasmic sperm injection,ICSI)。并且尝试了ICSI技术生产绵羊转基因胚胎的可能性。实验1比较了绵羊卵母细胞孤雌激活的3种化学方法。结果显示,Ionomvcin/3 h/6-dimethylaminopuri... 详细信息

本文的主要目标是建立绵羊胞内单精子注射技术(intracyioplasmic sperm injection,ICSI)。并且尝试了ICSI技术生产绵羊转基因胚胎的可能性。实验1比较了绵羊卵母细胞孤雌激活的3种化学方法。结果显示,Ionomvcin/3 h/6-dimethylaminopurine(6-DMAP)和Ionomycin激活胚的卵裂率(71.7%和91.8%)和囊胚率(17.4%和11%)显著(P0.05)。这些ICSI囊胚在冷冻前后均能孵化,显示初步建立了绵羊ICSI技术。另外,我们探索了ICSI技术生产转基因胚胎的可能性,-20℃冻融1次的死精子与pEGFP-N1质粒共注射,33枚2-细胞期ICSI胚胎中,2枚可见GFP蛋白。其中1枚停止发育,另外1枚继续发育至16-细胞期,仍然可见GFP基因的表达。4枚解冻的ICSI囊胚手术移植给2只发情同期化受体绵羊,60天时,B超未见怀孕。本文初步结果表明,ICSI技术生产转基因绵羊有可能性,需深入研究。

关键词：绵羊胞内单精子注射技术孤雌激活 ICSI 转基因

端粒酶催化亚基基因在小鼠胚胎发育早期的转录活性

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生物化学与生物物理进展 2005年第3期32卷 282-287页

作者：王宇姚慧安晓荣陈永福苟克勉中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室北京100094

用RT-PCR引物分别扩增成年昆明(KM) 小鼠睾丸、脾脏、肾脏、肝脏和胸腺组织的总RNA发现,端粒酶催化亚基基因tert在这些组织中都有转录,目标产物正确组装到PMD 18-T载体后测序,结果与已知cDNA序列一致. PMSG/hCG超数排卵方法获得KM小鼠... 详细信息

用RT-PCR引物分别扩增成年昆明(KM) 小鼠睾丸、脾脏、肾脏、肝脏和胸腺组织的总RNA发现,端粒酶催化亚基基因tert在这些组织中都有转录,目标产物正确组装到PMD 18-T载体后测序,结果与已知cDNA序列一致. PMSG/hCG超数排卵方法获得KM小鼠成熟卵母细胞和CZB溶液体外培养的胚胎(KM ♀×KM♂),用酸性Tyrode蒺s溶液消化透明带后,采用巢式RT-PCR,同时分析tert基因和持家基因hprt的转录发现,对于单个样品来说, 全部卵母细胞(15 h-post hCG,10/10) 都存在hprt转录本,其中,只有40%(4/10) 还同时存在tert转录本. 原核形成初期(20 h-post hCG,6/6) 和原核晚期(30 h post-hCG,8/8) 的受精卵,以及发育至2-C早期的胚胎(35 h-post hCG,7/7) 都不转录tert基因,只有hprtmRNA存在;2-C晚期(50 h-post hCG)时,两个基因同时转录(4/8)和一个基因单独转录(4/8)的胚胎各占50%;从4-C阶段(65 h-post hCG,4/4)开始,包括8-C阶段(75 h-post hCG,4/4),桑椹胚阶段(93 h-post hCG,4/4),直至囊胚阶段(118 h-post hCG,4/4),所有的胚胎都同时转录tert和hprt基因,而且转录水平明显升高. 以20枚胚胎量为模板进行RT-PCR发现,原核早期,原核晚期的胚胎中仍然没有tert基因转录,只有hprtmRNA,但是,在2-C早期胚胎中同时检测到了hprt和tert两种mRNA. ?

关键词：小鼠卵母细胞胚胎 tert基因 hprt基因端粒酶 RT-PCR

硬脂酰-辅酶A脱氢酶基因在食品级乳酸菌中的表达

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生物工程学报 2012年第9期28卷 1106-1117页

作者：王腊梅李世丽苟克勉罗玉柱甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室北京100193

为了实现硬脂酰-辅酶A脱氢酶1编码基因在乳酸乳球菌中的表达,采用PCR技术扩增获得人类scd1的编码序列。Nco I和Xba I双酶切后定向插入到食品级表达载体pNZ8149中,构建表达载体pNZ8149-scd1。电转化乳酸乳球菌NZ3900,经菌落PCR和测序鉴定... 详细信息

为了实现硬脂酰-辅酶A脱氢酶1编码基因在乳酸乳球菌中的表达,采用PCR技术扩增获得人类scd1的编码序列。Nco I和Xba I双酶切后定向插入到食品级表达载体pNZ8149中,构建表达载体pNZ8149-scd1。电转化乳酸乳球菌NZ3900,经菌落PCR和测序鉴定scd1基因成功插入到乳酸乳球菌中。在乳链菌肽诱导下进行scd1的表达,转化株提取脂肪酸,进行脂肪酸含量的气相色谱分析。结果显示,SCD1转化菌株中的C16∶1n-7和C18∶1n-7脂肪酸组分比转化pNZ8149的对照组乳酸菌分别提高了92%~169%和53%~127%。文中以scd1基因为例,尝试并证明了脂肪酸脱氢酶类基因能够在食品级乳酸菌中有效表达,为后续研究奠定了基础。

关键词：硬脂酰-CoA脱氢酶乳酸乳球菌脂肪酸

棉花脂肪酸脱氢酶FAD2能够实现转基因小鼠n-6脂肪酸的内源性生物合成

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中国科学（C辑） 2009年第8期39卷 755-760页

作者：陈青柳青吴至芳王宗义苟克勉中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室北京100193 Blackmountain Laboratory CSIRO Plant Industry Canberra Australia 中国农业大学动物科技学院北京100193

脂肪酸脱氢酶FAD2(fatty acid desaturase-2)是一种将油酸(18:1)脱氢生成亚油酸(18:2n-6)的植物脱氢酶.在前期研究fad2转基因小鼠模型的基础上,本文新构建CMV promoter/fad2cDNA/SV40poly A真核表达载体,通过显微注射技术,生产出转基因... 详细信息

脂肪酸脱氢酶FAD2(fatty acid desaturase-2)是一种将油酸(18:1)脱氢生成亚油酸(18:2n-6)的植物脱氢酶.在前期研究fad2转基因小鼠模型的基础上,本文新构建CMV promoter/fad2cDNA/SV40poly A真核表达载体,通过显微注射技术,生产出转基因小鼠.7只妊娠受体合计移植184枚受精卵,出生63只(34.2%)健康的成年小鼠.PCR和Southern blotting结果显示,有10只小鼠整合了外源基因,总的转基因效率是15.9%(10/63).随后,转基因小鼠与C57BL/6小鼠杂交选育,建立了10个转基因家系.最后,以6周龄的转基因后代同窝雌鼠作为样本(包括转基因阳性和阴性雌鼠),利用微量气相色谱方法,分析了腿部肌肉组织和肝脏组织的多种n-6脂肪酸的百分含量,结果显示,只有1个(10%)家系的转基因小鼠表达了外源基因,能够有效地改变目标脂肪酸的成分.其中肌肉组织中油酸百分含量(8.580±1.232)与野生型小鼠(10.812±1.244)没有区别(P≥0.05);但是,亚油酸的含量(15.653±0.557),明显(P<0.05)高于野生型小鼠(13.168±0.634),相对含量提高了19%;同时,下游的花生四烯酸(20:4n-6)的含量(12.850±1.479)也明显(P<0.01)高于野生型小鼠(6.871±0.665),相对含量更是提高了87%;转基因肝脏组织的亚油酸(15.962±0.552vs15.200±0.170)和花生四烯酸(12.607±0.623vs11.601±0.492)含量也明显高于野生型小鼠组织(P<0.05).本实验表明,植物fad2基因能够有效地促进转基因小鼠自身生物合成n-6脂肪酸.在国际上首次成功地建立了fad2转基因小鼠的表达模型,为相关疾病的研究奠定了基础.

关键词：脂肪酸脱氢酶 FAD2 转基因小鼠油酸亚油酸花生四烯酸

精子头后部质膜融合蛋白fertilin的研究进展

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细胞生物学杂志 1998年第4期20卷 161-165页

作者：苟克勉邓继先陈永福军事医学科学院生物工程研究所北京100071 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京100094

精子头后部(或赤道区)表面fertilin糖蛋白由相关的两个跨膜亚基α和β构成异二体形式。这两个亚基前体均含有金属蛋白酶区(met-alloprotease domain)和整联蛋白配体区(disin-tegrin domain),属于ADAMs gene家族。α和β前体分别在睾丸... 详细信息

精子头后部(或赤道区)表面fertilin糖蛋白由相关的两个跨膜亚基α和β构成异二体形式。这两个亚基前体均含有金属蛋白酶区(met-alloprotease domain)和整联蛋白配体区(disin-tegrin domain),属于ADAMs gene家族。α和β前体分别在睾丸和附睾中从上述两区域连接处水解后,得到成熟型亚基。受精时,穿过透明带的顶体反应后精子借助β亚基的disintegrin肽段与卵母细胞表面的整联蛋白结合,同时fertilin结构发生变化,暴露出α亚基上潜在的融合肽段(90—111aa),并介导精子与卵母细胞发生质膜融合,最终完成受精过程。

关键词：精子 fertilin糖蛋白结构功能质膜融合蛋白

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哺乳类动物受精的分子基础

生殖与避孕 2000年第6期20卷 323-328,337页

作者：苟克勉安晓荣陈永福张忠诚中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京100094 中国农业大学动物科技学院北京100094

哺乳类动物受精时,直线前进的精子经过在雌性动物生殖道中自发的获能过程后,成为具有受精能力的成熟精子.运行至输卵管壶腹部的获能精子与卵丘-卵母细胞复合体相遇后开始受精过程.哺乳类的受精,除了精子与卵母细胞外基质层(卵丘细胞层... 详细信息

哺乳类动物受精时,直线前进的精子经过在雌性动物生殖道中自发的获能过程后,成为具有受精能力的成熟精子.运行至输卵管壶腹部的获能精子与卵丘-卵母细胞复合体相遇后开始受精过程.哺乳类的受精,除了精子与卵母细胞外基质层(卵丘细胞层和透明带)、精子与卵母细胞质膜间的相互作用过程外,还包括精子的顶体反应、卵母细胞的透明带反应和卵黄膜封锁反应等生理生化过程.

关键词：哺乳动物受精分子生物学

利用卵胞浆精子注射(ICSI)技术生产转基因小鼠

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生物工程学报 2006年第5期22卷 784-788页

作者：李明严阿勇姚慧安晓荣苟克勉中国农业大学农业生物技术国家重点实验室生物学院北京100094

在掌握小鼠ICSI技术的基础上,进行了ICSI技术生产转基因小鼠的研究。来自成年KM小鼠附睾尾的精子,使用未加抗冻剂的HEPES-CZB溶液,在液氮中冻融1次后,用于本实验。解冻精子与DNA混匀1min后,精子头被显微注射到B6D2F1小鼠成熟卵母细胞质... 详细信息

在掌握小鼠ICSI技术的基础上,进行了ICSI技术生产转基因小鼠的研究。来自成年KM小鼠附睾尾的精子,使用未加抗冻剂的HEPES-CZB溶液,在液氮中冻融1次后,用于本实验。解冻精子与DNA混匀1min后,精子头被显微注射到B6D2F1小鼠成熟卵母细胞质中。精子头与pEGFP-N1环状DNA共注射生产的ICSI受精卵,在CZB溶液中培养至囊胚期时,39.1%(9/23)的囊胚表达GFP基因。精子注射后6h,直接移植ICSI受精卵后,7只妊娠受体一共产仔30只,效率为23.8%(30/126)。Southernblot分析其中16只小鼠发现,3只(18.8%)转基因小鼠同时整合了GFP和Neomycin基因,它们全部来自精子和线性DNA混合的实验组(阳性效率为33.3%,3/9),相反,精子与环状质粒DNA共注射生产的7只ICSI后代中,没有检测到外源基因。转基因小鼠整合的外源基因能够传递给它们后代。结果说明,利用ICSI技术可以高效地生产转基因小鼠,宿主基因组可能更容易整合线性化的外源基因。

关键词： ICSI 囊胚小鼠转基因 Southern blot

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动物体细胞克隆技术及其应用前景

高技术通讯 2001年第11期11卷 104-106页

作者：陈永福苟克勉安晓荣中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京100094

综述了动物体细胞克隆技术及其应用前景 ,着重探讨了利用体细胞克隆技术在生产转基因动物、扩大特别优良家畜个体的数量以及作为保护濒临灭绝的动物遗传资源等三方面的应用前景。

关键词：动物体细胞克隆应用前景基因工程转基因动物家畜