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基因1型鹅星状病毒VP27蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

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中国畜牧兽医 2024年第6期51卷 2576-2584页

作者：向勇李林林张俊勤董嘉文黄允真翟颀徐志宏廖明孙敏华广东省农业科学院动物卫生研究所农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广州510640 仲恺农业工程学院动物科技学院广州510225

【目的】制备可特异性识别基因1型鹅星状病毒(Goose astrovirus genotype 1,GAstV-1)且与GAstV-2不发生交叉反应的多克隆抗体,以期为后续GAstV-1免疫检测技术的建立提供材料。【方法】通过比对GAstV-1与GAstV-2衣壳蛋白的氨基酸序列以... 详细信息

【目的】制备可特异性识别基因1型鹅星状病毒(Goose astrovirus genotype 1,GAstV-1)且与GAstV-2不发生交叉反应的多克隆抗体,以期为后续GAstV-1免疫检测技术的建立提供材料。【方法】通过比对GAstV-1与GAstV-2衣壳蛋白的氨基酸序列以寻找其差异较大的区域作为靶基因。对GAstV-1 GDYJ-21-01株VP27基因密码子进行偏嗜性优化合成,构建原核表达质粒pCZN1-GAstV-1 VP27,转化大肠杆菌Top10感受态细胞以诱导表达VP27蛋白;将纯化后的VP27蛋白免疫新西兰白兔后收获抗血清以制备GAstV-1 VP27多克隆抗体,通过间接ELISA和SDS-PAGE分析该纯化抗体的效价和纯度,并利用间接免疫荧光试验(IFA)检测多克隆抗体的特异性。【结果】试验成功构建重组质粒pCZN1-GAstV-1 VP27;SDS-PAGE显示其表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA试验结果显示,纯化后的GAstV-1 VP27多克隆抗体效价高达1∶9 841 500,纯度高于85%。IFA结果显示,GAstV-1 VP27多克隆抗体可特异性识别GAstV-1,且与GAstV-2无交叉反应。临床病料组织检测结果显示,GAstV-1核酸阳性的病料组织均可出现特异性荧光,而GAstV-2核酸阳性且GAstV-1核酸阴性的病料组织未出现荧光。【结论】本研究获得了高效价且可特异性识别GAstV-1(与GAstV-2无交叉反应)的VP27多克隆抗体,为建立鉴别诊断GAstV-1的抗原免疫检测技术奠定了基础。

关键词： 1型鹅星状病毒(GAstV-1) VP27 原核表达多克隆抗体

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三种消毒剂对鹅星状病毒杀灭效果的评价

广东畜牧兽医科技 2024年第3期49卷 88-92页

作者：邝瑞欢黄允真李林林向勇翟颀孙敏华李珂信爱国李海贤董嘉文广东省农业科学院动物卫生研究所/农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室广东广州510640 云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所云南昆明650224 广州五丰动物保健品有限公司广东广州510640

为了解不同成分的消毒剂对鹅星状病毒的杀灭效果,该试验选择复方戊二醛、二氯异氰脲酸钠粉、聚维酮碘溶液进行杀灭效果评估,以指导临床实践中的消毒灭源工作。经对三种消毒剂在10℃、25℃、37℃下不同稀释比例、不同作用时间对鹅星状病... 详细信息

为了解不同成分的消毒剂对鹅星状病毒的杀灭效果,该试验选择复方戊二醛、二氯异氰脲酸钠粉、聚维酮碘溶液进行杀灭效果评估,以指导临床实践中的消毒灭源工作。经对三种消毒剂在10℃、25℃、37℃下不同稀释比例、不同作用时间对鹅星状病毒的杀灭效果进行实验室评价,结果显示:在室温环境下(25℃),作用时间为1 min、5 min和10 min,复方戊二醛1∶80倍稀释可完全杀灭鹅星状病毒(104.0 EID50),而复方戊二醛1∶300倍稀释及其他两种消毒剂在推荐使用浓度下均未能有效杀灭鹅星状病毒。对于尿囊液里高含量(104.0 EID50)的鹅星状病毒,1∶80倍稀释的复方戊二醛溶液在10℃时需要作用10 min才能有效杀灭星状病毒,但尿囊液里低含量(103.0 EID50)的鹅星状病毒在此浓度下作用1 min就能被完全杀灭。当温度达到25℃时,1∶80倍稀释的复方戊二醛溶液1 min即可杀灭鹅星状病毒;1:160倍稀释的复方戊二醛溶液则需要10 min才能完全杀灭鹅星状病毒。继续升高温度至37℃,1∶80和1∶160倍稀释的复方戊二醛溶液与鹅星状病毒作用1 min即可起到有效杀灭效果。综上所述,采用1∶80倍稀释的复方戊二醛杀灭鹅星状病毒(104.0 EID50),在10℃、25℃和37℃作用的最短时间分别是10 min、1 min和1 min。该研究明确了三种不同消毒剂首次用于消毒,在不同温度和作用时间下对鹅星状病毒的杀灭效果,为鹅星状病毒的生物安全防控提供参考。

关键词：鹅星状病毒消毒复方戊二醛异氰脲酸钠聚维酮碘

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柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白的初步研究

柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白的初步研究

作者：翟颀中国农业科学院

学位级别：硕士

鸡球虫病在世界范围内严重影响养鸡业的健康发展,给养鸡业造成巨大的经济损失,该病主要是由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道引起。在7种艾美耳球虫中,柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是分布最广、致病力最强的球虫之一,它寄生在盲肠的黏膜下... 详细信息

鸡球虫病在世界范围内严重影响养鸡业的健康发展,给养鸡业造成巨大的经济损失,该病主要是由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道引起。在7种艾美耳球虫中,柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是分布最广、致病力最强的球虫之一,它寄生在盲肠的黏膜下,引起出血性肠炎,可导致鸡死亡。鸡球虫属于顶复器门原虫,顶复器门原虫是一类专一性的细胞内寄生虫,这类寄生虫尽管入侵的宿主细胞各不相同,但它们都有一个共同保守的入侵机制,当虫体黏附宿主细胞后,在虫体顶端与宿主细胞膜表面形成一个紧密的运动接触环(Moving Junction,MJ),这一特殊结构在虫体入侵宿主细胞过程中发挥至关重要的作用。研究发现由微线体分泌的顶体膜抗原1(Apical membrance protein-1,AMA1)是组成MJ的关键分子,因此,与AMA1相互作用的分子可能参与形成MJ,并在虫体入侵宿主细胞过程中必不可少。为了弄清楚柔嫩艾美耳球虫AMA1的相互作用分子以及在虫体入侵过程中发挥的作用,本实验室前期利用酵母双杂交技术,以柔嫩艾美耳球虫顶体膜抗原1(Et AMA1)为诱饵,筛选了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交c DNA文库,获得一些可能与Et AMA1相互作用蛋白的ESTs序列。本研究选取其中编号为559和39的两个EST序列,对其进行克隆、表达和功能初步分析,并对其与Et AMA1的相互作用关系进行了验证。1.柔嫩艾美耳球虫CHP559和CHP39基因的克隆及生物信息学分析选取的两个EST序列均含有3’末端的Ploy(A)尾,利用5’RACE技术获得了这两个基因含完整开放阅读框的全长c DNA序列,编号559与39基因的ORF分别与柔嫩艾美耳球虫保守的假想蛋白(hypothetical protein,conserved)ETH0024035与ETH0029745有100%同源,因此,分别将2个基因命名为Et CHP559和Et CHP39。Et CHP559基因全长1 746 bp,ORF长1 224 bp,编码407个氨基酸,编码蛋白的分子量为46.04 k Da,有跨膜结构和信号肽,没有保守结构域,有15个抗原位点。Et CHP39基因全长1 344 bp,ORF长873 bp,编码290个氨基酸,预测分子量为32.6 k Da,无跨膜结构和信号肽,没有保守结构域,有9个抗原位点。经荧光定量PCR检测发现,Et CHP559基因在孢子化卵囊和子孢子发育阶段有转录,子孢子阶段的转录水平最高,表明Et CHP559是在子孢子阶段高效表达的基因。Et CHP39基因在4个发育阶段均有转录,但转录水平不同,其中在孢子化卵囊阶段转录水平最高,其次在未孢子化卵囊的转录水平高于子孢子和裂殖子,表明Et CHP39基因的转录水平受到虫体阶段性的调控。2.柔嫩艾美耳球虫两个保守蛋白Et CHP559和Et CHP39的原核表达及功能初步研究将Et CHP559基因克隆到原核表达载体p GEX-4T-2和p Cold-TF中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导成功表达了重组蛋白GST-Et CHP559和His-Et CHP559,其中重组蛋白GST-Et CHP559为包涵体表达,重组蛋白His-Et CHP559有可溶性表达。将Et CHP39基因克隆到原核表达载体p ET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导成功表达了重组蛋白His-Et CHP39,且以包涵体形式表达。分别利用Ni柱亲和层析和切胶纯化的方式获得了重组蛋白His-Et CHP559和His-Et CHP39,用纯化的蛋白免疫家兔获得多抗血清,经Western-blot分析表明重组蛋白Et CHP559和Et CHP39都具有良好的免疫原性和反应原性。采用间接免疫荧光定位技术对Et CHP559和Et CHP39蛋白在球虫不同发育阶段的分布和定位进行分析,结果显示,Et CHP559蛋白在未入侵前主要位于子孢子的表面,当准备入侵时该蛋白的表达量上升并趋向于顶端,在子孢子接入DF-1细胞2 h后,发现该蛋白主要位于虫体的顶端,子孢子入侵DF-1细胞24 h后,蛋白的表达增加,且逐渐往虫体的后端分泌;Et CHP39在未入侵前主要位于子孢子的顶端,当准备入侵时该蛋白分泌到子孢子的表面以及顶端,子孢子加入DF-1细胞2 h后,发现该蛋白主要位于虫体的顶端,入侵DF-1细胞24 h后,蛋白的表达增加,且逐渐往虫体的后端分泌,当虫体发育为裂殖子时,该蛋白也主要位于裂殖子的顶端。通过体外抑制实验检测不同浓度的多抗对子孢子入侵DF-1细胞的影响,结果显示,anti-r Et CHP559抗体作用子孢子后,与正常兔血清Ig G组相比子孢子入侵DF-1细胞的能力明显下降,且随着抗体浓度的不断增大,

关键词：球虫病柔嫩艾美耳球虫保守蛋白 CHP559 CHP39 入侵蛋白互作

柔嫩艾美耳球虫保守蛋白CHP559基因克隆与真核表达

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生物技术通报 2015年第7期31卷 161-168页

作者：翟颀黄兵董辉赵其平朱顺海梁思婷李莎杨斯涵韩红玉中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室上海200241

为构建柔嫩艾美耳球虫保守蛋白Et CHP559基因的真核表达重组质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,并转染DF-1细胞进行表达。利用5'RACE技术克隆获得了柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因全长c DNA序列,该基因全长为1 746 bp,ORF为104-1 327 bp,编码... 详细信息

为构建柔嫩艾美耳球虫保守蛋白Et CHP559基因的真核表达重组质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,并转染DF-1细胞进行表达。利用5'RACE技术克隆获得了柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因全长c DNA序列,该基因全长为1 746 bp,ORF为104-1 327 bp,编码407个氨基酸,编码蛋白的分子量约为46 k D,并利用生物信息学分析该基因编码蛋白的性质、结构等特征,发现该蛋白含有跨膜结构和信号肽。通过RT-PCR扩增得到含完整开放阅读框的基因片段,并将其与真核表达载体pc DNA3.1-flag连接,构建了真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,所构建的真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559经过PCR和双酶切鉴定,可见一条大小约为1 224 bp的目的条带;重组质粒转染DF-1细胞后,免疫印迹检测可见大小约为47 k D的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验显示在DF-1细胞中检测到绿色荧光。这些研究结果表明已成功获得了Et CHP559的全长序列,并成功构建了Et CHP559的真核重组表达质粒,在真核细胞DF-1中获得表达,为深入研究Et CHP559的功能奠定了基础。

关键词：柔嫩艾美耳球虫 CHP559基因 DF-1细胞真核表达

柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其在蛋白定位中的应用

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中国动物传染病学报 2015年第2期23卷 47-52页

作者：李莎梁思婷赵其平韩红玉朱顺海翟颀杨斯涵黄兵董辉中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241 上海师范大学生命与环境科学学院上海200234 云南农业大学动物科学技术学院昆明650201 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

为了制备柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella lactate dehydrogenase,Et LDH)单克隆抗体,用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选... 详细信息

为了制备柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella lactate dehydrogenase,Et LDH)单克隆抗体,用大肠杆菌表达的重组Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,经5次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,经3次亚克隆后获得2株能稳定分泌Et LDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7和2H4,抗体亚类鉴定均为Ig G1,腹水效价分别为1:8000和1:64 000。Western blot结果显示2F7抗体能识别柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中大小约为35 k Da的天然蛋白。利用该单抗对Et LDH在柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的分布进行了定位,结果显示该蛋白主要分布于裂殖子的细胞质,表明成功地制备了Et LDH单克隆抗体,为深入研究Et LDH的功能和特性奠定了基础。

关键词：柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶单克隆抗体免疫荧光定位

柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2真核表达质粒的构建及在细胞中的表达

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中国动物传染病学报 2015年第2期23卷 53-59页

作者：杨斯涵赵其平韩红玉朱顺海李莎翟颀梁思婷杨亮宇黄兵董辉云南农业大学动物科学技术学院昆明650201 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室上海200241

为构建柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2(Eimeria tenella silent information regulator 2,Et SIR2)的真核表达质粒,以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子c DNA为模板,PCR扩增出Et SIR2基因,PCR产物经酶切回收纯化目的片段后与经相应酶切的真... 详细信息

为构建柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2(Eimeria tenella silent information regulator 2,Et SIR2)的真核表达质粒,以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子c DNA为模板,PCR扩增出Et SIR2基因,PCR产物经酶切回收纯化目的片段后与经相应酶切的真核表达载体p CAGGs连接。连接产物经PCR和酶切鉴定,再经测序鉴定正确后,分别转染DF-1细胞和BHK细胞进行表达,用Western blot和间接免疫荧光鉴定Et SIR2基因的表达情况。结果表明:成功扩增了Et SIR2基因,长度为909 bp;Western blot可见大小约为37 k Da的表达蛋白条带;间接免疫荧光可以检测到特异性绿色荧光,表明成功构建了Et SIR2的真核表达质粒p CAGGsEt SIR2,并能在哺乳动物细胞和禽类细胞中表达。该研究结果为深入研究Et SIR2的生物学特性和球虫DNA疫苗的研制打下了基础。

关键词：柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2 DF-1细胞 BHK细胞真核表达

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牛结节性皮肤病病毒基因组学研究进展

广东农业科学 2022年第7期49卷 97-104页

作者：翟颀黄敏霞吕殿红贾春玲周秀蓉温肖会罗胜军广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州510225 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心广东肇庆526238

牛结节性皮肤病(Lumpy Skin Disease,LSD)是一种由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease Virus,LSDV)引起牛产生结节特征性病变的动物传染病,在东亚、南亚和东南亚等国家广泛流行,对当地养牛业造成严重的经济损失。目前我国将LSD作为... 详细信息

牛结节性皮肤病(Lumpy Skin Disease,LSD)是一种由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease Virus,LSDV)引起牛产生结节特征性病变的动物传染病,在东亚、南亚和东南亚等国家广泛流行,对当地养牛业造成严重的经济损失。目前我国将LSD作为二类动物疫病管理,自2019年以来,国内已有10多个省份报告过LSD疫情,疫情形势十分严峻。当前分离增殖LSDV较优的细胞为牛肾细胞。LSDV为痘病毒科山羊痘病毒属,其病毒粒子大小约为290 nm×270 nm,具有两种存在形态,病毒基因组复杂庞大,约为151 kb,包含150多个基因。目前GenBank数据库中仅保存有40多条LSDV病毒株的全基因组序列信息,流行毒株除了田间野毒株,近年来在亚洲部分地区还出现了田间野毒株和疫苗毒株的重组毒株,并且流行的重组毒株具有致病性,给未来LSD的疫苗研制和防控策略制定提出了新挑战。综述了LSD的病原学,以及非洲、欧洲和亚洲不同地区LSDV毒株全基因组学的研究进展,以期为LSD的防控和深入研究提供参考。

关键词：牛结节性皮肤病病毒(LSDV) 病原学基因组学测序重组毒株

广东地区猪群新发塞内卡病毒流行株的分离鉴定及遗传进化分析

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广东农业科学 2019年第6期46卷 125-132页

作者：林秀银温肖会吕殿红翟少伦霍玮翟颀魏文康杨彩娟仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州510225 广东省农业科学院动物卫生研究所/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室广东广州510640 广东省动物防疫物资储备中心广东广州510520

【目的】检测广东两猪场新发的鼻镜与蹄冠水疱病病原,获得新发塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)流行株,为后续研究提供材料。【方法】应用SVA RT-PCR、荧光PCR等方法对采集的病料进行初步筛查,再将水泡皮进行处理接种于ST细胞、BHK-21细胞... 详细信息

【目的】检测广东两猪场新发的鼻镜与蹄冠水疱病病原,获得新发塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)流行株,为后续研究提供材料。【方法】应用SVA RT-PCR、荧光PCR等方法对采集的病料进行初步筛查,再将水泡皮进行处理接种于ST细胞、BHK-21细胞上,用SVA特异性引物对细胞上清液进行扩增,测序并分析序列,采用蔗糖浓度梯度方法纯化病毒进行电子显微镜形态观察,并对病毒分离株的TCID50进行测定。【结果】经SVA RT-PCR与荧光PCR方法初步诊断该猪群为SVA感染;细胞接毒培养发现,自第6代起,细胞出现典型CPE,电镜观察可见25 nm左右的病毒颗粒,扩增序列提交NCBI Blastn比对鉴定为SVA;测得毒株SVA CH-GDBL1-2016的TCID50为106.8,毒株SVA CH-GDBL2-2016的TCID50为106.7。【结论】SVACH-GDBL1-2016和SVA CH-GDBL2-2016可为后续塞内卡病毒病的诊断和疫苗研制提供材料基础。

关键词：塞内卡病毒口蹄疫猪原发性水疱病分离鉴定序列分析

禽沙门氏菌、大肠杆菌及产气荚膜梭菌多重荧光PCR检测方法的建立及应用

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高原农业 2023年第5期7卷 514-522页

作者：赵亮温肖会翟颀吕殿红李家奎西藏农牧学院动物科学学院西藏林芝860000 广东省农业科学院动物卫生研究所农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东广州510640 华中农业大学动物科技学院动物医学院湖北武汉430070

为建立禽沙门氏菌、大肠杆菌及产气荚膜梭菌的多重荧光PCR鉴别检测方法,根据GenBank中沙门氏菌invA、大肠杆菌phoA、产气荚膜梭菌plc基因序列分别设计特异性引物和Taqman探针,并优化PCR反应体系和反应条件,应用该方法对临床样品进行检... 详细信息

为建立禽沙门氏菌、大肠杆菌及产气荚膜梭菌的多重荧光PCR鉴别检测方法,根据GenBank中沙门氏菌invA、大肠杆菌phoA、产气荚膜梭菌plc基因序列分别设计特异性引物和Taqman探针,并优化PCR反应体系和反应条件,应用该方法对临床样品进行检测。结果显示:该方法与巴氏杆菌、新城疫病毒和鸭疫里默氏杆菌等无交叉反应,具有较高特异性;沙门氏菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌最低检测限度(LOD)均达66.9 copies/μL,相比检测沙门氏菌、大肠杆菌及产气荚膜梭菌的普通PCR的敏感性分别高100倍、1000倍和1000倍,具有高敏感性;组内和组间变异系数均低于3.84%,稳定性良好;通过对30份临床样品和已鉴定的23份菌株进行检测,显示该检测方法符合率为100%。建立的多重荧光PCR方法特异性和敏感性较好,适用于临床禽沙门氏菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌单一或混合感染的快速诊断及流行病学调查,提高了家禽腹泻疾病的诊断效率,具有良好应用价值。

关键词：禽腹泻沙门氏菌大肠杆菌产气荚膜梭菌多重荧光PCR