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鼠源ATP5B基因克隆及其原核和真核表达载体构建

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南方农业学报 2024年第6期55卷 1807-1816页

作者：段辰星黄袁慧闵开骏李晓宁罗廷荣广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西南宁530004 广西兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西南宁530004 广西高校动物疫病预防与控制重点实验室广西南宁530004

【目的】克隆鼠源ATP5B基因,构建其原核和真核表达载体,为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】克隆鼠源ATP5B基因编码区(CDS),运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析... 详细信息

【目的】克隆鼠源ATP5B基因,构建其原核和真核表达载体,为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】克隆鼠源ATP5B基因编码区(CDS),运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析。采用同源重组方法构建原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag。以原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,分析最适诱导温度和IPTG浓度。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测ATP5B蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】鼠源ATP5B基因CDS长1590 bp,鼠源ATP5B蛋白由529个氨基酸残基构成,分子量为55 kD,理论等电点(pI)为5.21,属于稳定的疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,不属于分泌蛋白;鼠源ATP5B蛋白二级结构中α-螺旋占43.67%,无规则卷曲占32.51%,β-转角占9.45%,延伸链占14.37%。原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag经IPTG诱导后,通过考马斯亮蓝染色和Western blotting在81 kD处成功检测到融合蛋白,且主要以包涵体形式表达,诱导条件以30℃、0.5 mmol/L IPTG的效果更好。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞后,在55 kD处检测到Flag标签特异性条带,即ATP5B蛋白在HEK-293T细胞中成功表达,IFA检测结果表明该蛋白主要定位在细胞质中。【结论】成功构建鼠源ATP5B基因原核和真核表达载体,原核表达载体表达出的融合蛋白主要以包涵体形式存在,只有少量可溶蛋白,真核表达的ATP5B蛋白主要定位在细胞质中。鼠源ATP5B蛋白是理化性质稳定的疏水性蛋白,无信号肽位点,不属于分泌蛋白。

关键词：鼠源ATP5B基因基因克隆生物信息学分析表达载体构建

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狂犬病病毒GX074株P-M^(S20F)突变体构建及其生长特性鉴定

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南方农业学报 2024年第1期55卷 253-262页

作者：彭璟李文芳陆丽莹韦显凯李晓宁罗廷荣广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广西南宁530004

【目的】明确狂犬病病毒(RABV)强毒株GX074的P蛋白和M蛋白第20位苯丙氨酸(Phe)替换至弱毒株r RC-HL的重组突变体在宿主细胞内的生长特性,为P蛋白和M蛋白转录复制机理研究提供理论依据。【方法】运用反向遗传技术以强毒株GX074的M蛋白第2... 详细信息

【目的】明确狂犬病病毒(RABV)强毒株GX074的P蛋白和M蛋白第20位苯丙氨酸(Phe)替换至弱毒株r RC-HL的重组突变体在宿主细胞内的生长特性,为P蛋白和M蛋白转录复制机理研究提供理论依据。【方法】运用反向遗传技术以强毒株GX074的M蛋白第20位Phe替换弱毒株r RC-HL(GX074P)的M蛋白第20位丝氨酸(Ser),构建r RC-HL(GX074P-M^(S20F))突变体感染性c DNA克隆并拯救病毒。以重组突变体感染BSR/T7-9细胞,进行多步生长曲线测定,比较重组突变体与亲本毒株的生长能力,采用Western blotting检测N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达水平,利用实时荧光定量PCR检测N基因、P基因和M基因的相对表达量。【结果】经RT-PCR和测序鉴定,拯救的突变体r RC-HL(GX074P-M^(S20F))M蛋白第20位Ser成功替换为Phe。多步生长曲线测定结果显示,构建的重组突变体在感染24、48、72和96 h后,病毒滴度均高于亲本弱毒株r RC-HL和对照弱毒株r RC-HL(GX074PM1),平均约为亲本弱毒株r RC-HL的10倍。在蛋白表达水平上,r RC-HL(GX074P-M^(S20F))毒株在感染48 h后,N蛋白和M蛋白相对表达水平均极显著高于亲本弱毒株r RC-HL(P<0.01),说明强毒株GX074的P蛋白联合M蛋白第20位Phe替换至弱毒株r RC-HL后,增加了突变体N蛋白和M蛋白表达。感染24和48 h后,r RC-HL(GX074P-M^(S20F))毒株N基因、P基因和M基因的相对表达量均高于亲本弱毒株r RC-HL和对照弱毒株r RC-HL(GX074PM1)。【结论】强毒株GX074的M蛋白第20位Phe替换可提高病毒的增殖能力,同时增强病毒的复制与转录能力,M蛋白第20位Phe可能是影响病毒复制和转录的关键位点。

关键词：狂犬病病毒(RABV) P蛋白 M蛋白生长特性反向遗传

基于狂犬病病毒G蛋白Ⅳ区抗原位点的多克隆抗体制备

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广西畜牧兽医 2024年第5期40卷 188-191页

作者：张传亮段辰星宋丹丹李晓宁罗廷荣广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心广西南宁530004 广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室广西南宁530004 广西高校动物疫病预防与控制重点实验室广西南宁530004

基于大肠杆菌原核表达的G重组蛋白缺少糖基化修饰,诱导机体产生中和抗体的能力较弱。为制备G蛋白多克隆抗体,针对G蛋白抗原Ⅳ区第251位氨基酸的中和抗原表位,以日本RABV疫苗株RC-HL的G蛋白序列为模板,设计了含有17个氨基酸的多肽序列MQT... 详细信息

基于大肠杆菌原核表达的G重组蛋白缺少糖基化修饰,诱导机体产生中和抗体的能力较弱。为制备G蛋白多克隆抗体,针对G蛋白抗原Ⅳ区第251位氨基酸的中和抗原表位,以日本RABV疫苗株RC-HL的G蛋白序列为模板,设计了含有17个氨基酸的多肽序列MQTSDETKWCPPDQLVN(G17),合成后偶联KLH蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠,采集血液分离血清获得抗G蛋白多克隆抗体。实验显示,制备的多克隆抗体效价在1∶500以上,在1∶200的稀释度下,可以对原核表达的G重组蛋白、真核表达的G重组蛋白进行Western Blot检测。基于狂犬病病毒G蛋白抗原位点Ⅳ区制备获得的抗G蛋白多克隆抗体具有反应性好及特异性强的特点,能够用于检测G重组蛋白,为进一步研究G蛋白功能、研发单抗和设计疫苗打下良好基础。

关键词：狂犬病病毒 G蛋白抗原位点Ⅳ区多克隆抗体

整合REV-LTR基因的MDV活疫苗与亲本CVI988/Rispens株的免疫效力比较

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中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 73-81页

作者：张秀梅宋翠萍谭磊孙英杰刘炜玮廖瑛丁铲仇旭升罗廷荣广西大学动物科学技术学院南宁530004 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

利用同源重组技术将禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)整合进CVI988/Rispens疫苗株基因组中所构建成的重组马立克氏病病毒株(r MDV-LTR株),具有较高的增殖效率。为比较r MDV-LTR株与亲本CVI988/Rispens株的免疫效力差... 详细信息

利用同源重组技术将禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)整合进CVI988/Rispens疫苗株基因组中所构建成的重组马立克氏病病毒株(r MDV-LTR株),具有较高的增殖效率。为比较r MDV-LTR株与亲本CVI988/Rispens株的免疫效力差异,开展了对这两种疫苗的比较试验。试验将这两种疫苗分别按照三个不同剂量经颈背部皮下接种1日龄SPF鸡。接种后第7 d,攻毒马立克氏病强毒株rMd5,连续观察60 d后进行剖检。临床病理观察结果发现,以不低于250 PFU/羽剂量的rMDV-LTR株或CVI988/Rispens株免疫SPF雏鸡都可以提供大于80%的免疫保护效率;以125 PFU/羽剂量的两种疫苗虽均不能提供大于80%的免疫保护效力,但rMDV-LTR株免疫组试验鸡未出现死亡,仅有2只鸡出现消瘦,剖解脏器无肿瘤,而CVI988/Rispens株免疫组鸡出现2只死亡,其中1只剖解后检出肿瘤。rMDV-LTR株和CVI988/Rispens株免疫组的免疫保护指数分别为77.78%和66.67%。由实验结果可见,在较小免疫剂量下,rMDV-LTR株免疫保护率高于亲本CVI988/Rispens疫苗株。说明重组毒rMDV-LTR疫苗株可以作为一种安全的、有效的新型MDV疫苗。

关键词：马立克氏病重组病毒禽网状内皮组织增生症病毒的长末端重复序列攻毒保护免疫效力

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生物素标记核酸探针的应用概况

中国兽医科技 1990年第2期20卷 17-18页

作者：余克伦罗廷荣广西农学院

目前,基因探针已用于人和家畜传染病、寄生虫病的诊断及流行病学的调查。它具有高度的敏感性,并且基因探针的检测是建立在探针和待检基因序列同源性的基础上,因此具有高度的特异性。基因探针采用的标记方法有同位素标记、生物素标记和... 详细信息

目前,基因探针已用于人和家畜传染病、寄生虫病的诊断及流行病学的调查。它具有高度的敏感性,并且基因探针的检测是建立在探针和待检基因序列同源性的基础上,因此具有高度的特异性。基因探针采用的标记方法有同位素标记、生物素标记和化学修饰核酸标记。但在这之前,用得较多的仍然是同位素标记的核酸探针。然而,由于放射性同位素的应用存在着不够安全方便、实验周期长、半衰期短、价格昂贵以及污染等缺点,使分子杂交技术的推广应用受到一定程度的局限。为此,各国研究工作者一直在探讨一种非放射性的核酸标记方法。近年出现的生物素标记的核酸探针技术就是这方面的一大突破,此种生物素化的脱氧尿嘧啶苷,

关键词：生物素标记核酸探针应用

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鸡病诊治彩色图解

广西狂犬病野毒株N和G基因的克隆与序列分析

丛书名：畜禽疾病诊治彩色图谱丛书

2000年

作者：陆芹章罗廷荣

本书着重介绍了鸡经常发生的20种疾病的诊断与防治技术，全书共124幅实物图片，显示出各种鸡病的临床症状及剖检特点，并说明其诊断方法和防治措施。

ISBN: (纸本)7806199349

关键词：鸡病学科:诊疗

来源：汇雅图书（南通市图书馆... 评论

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汇雅图书（南通市图书馆）

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中国预防兽医学报 2005年第4期27卷 245-249页

作者：罗廷荣南松剑余克伦广西大学动物科学技术学院广西南宁530005

从广西南宁、隆安和巴马分离到三株狂犬病病毒野毒株,分别编号为GXN119、GXLA和GXBM。对三株的N基因和GXN119、GXBM株的G基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。将测序所得结果和收集到的国内外已发表毒株相应基因进行了核苷酸和推定氨基... 详细信息

从广西南宁、隆安和巴马分离到三株狂犬病病毒野毒株,分别编号为GXN119、GXLA和GXBM。对三株的N基因和GXN119、GXBM株的G基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。将测序所得结果和收集到的国内外已发表毒株相应基因进行了核苷酸和推定氨基酸的序列进行比较分析。三株野毒之间N基因的核苷酸同源性分别为:89.1%(GXN119/GXBM)、89.7%(GXN119/GXLA)和89.4%(GXLA/GXBM),G基因的核苷酸同源性为86.7%(GXN119/GXBM)。比较N基因推导氨基酸序列同源性,分别为:97.8%(GXN119/GXBM)、97.8%(GXN119/GXLA)和99.1%(GXLA/GXBM),表明N基因同义变异较多。将两株野毒株GXN119、GXBM与人用疫苗3aG株和兽用疫苗ERA株的G基因进行了核苷酸序列比较,同源性介于82.7%～84.0%之间,推定氨基酸同源性在88.0%～91.6%之间。N蛋白的第40位Ser和106位Asp显示了广西狂犬病流行病学的区域特异性。

关键词：狂犬病病毒 N基因 G基因序列分析

鸡新城疫LaSota株免疫雏鸡后其体内残毒量与免疫的关系

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中国兽医科技 1990年第10期20卷 21-23页

作者：余克伦罗廷荣莫里广西农学院

笔者采用常规细胞培养法测定经LaSota株滴鼻免疫10日龄内雏鸡的各器官含毒量,证明含毒量与各日龄雏鸡HI抗体滴度有关,同时观察不同日龄雏鸡免疫后HI抗体滴度变化,为雏鸡早期免疫提供依据。(一)材料与方法1.试验雏鸡:刚出壳的红布萝雏鸡... 详细信息

笔者采用常规细胞培养法测定经LaSota株滴鼻免疫10日龄内雏鸡的各器官含毒量,证明含毒量与各日龄雏鸡HI抗体滴度有关,同时观察不同日龄雏鸡免疫后HI抗体滴度变化,为雏鸡早期免疫提供依据。(一)材料与方法1.试验雏鸡:刚出壳的红布萝雏鸡200只,由广西农学院牧试站供给。雏鸡来源于同群母鸡,并抽样测定其母代的HI滴度。***株:由中国兽药监察所引进,广西农学院兽医微生物教研室传代,用于雏鸡的免疫和HI试验。3.鸡胚:选用广西农学院牧试站的来航鸡蛋,孵化9日供细胞培养用。4.鸡红细胞:用2只以上成年公鸡无菌采血加入含有枸橼酸钠试管中,混合均匀后用生理盐水洗3次,使用时配成1％红细胞悬液。

关键词：鸡雏鸡新城疫Lasota 免疫残毒量

仙人·妖人·女人——《西游记》中女性形象浅析

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思茅师范高等专科学校学报 2009年第4期25卷 83-89页

作者：罗廷荣普洱市思茅区文化体育局云南普洱665000

通过对《西游记》中几个有代表性的典型女性形象的分析,来理解那些生活在不同社会环境里的女人的思想意识和行为表现,进而探讨女人的自然属性和社会属性的最佳结合点。

关键词：《西游记》女性形象仙人妖人女人生活环境