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青海牦牛源益生菌分离、鉴定及其益生特性的研究

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动物营养学报 2025年第1期37卷 658-671页

作者：谢林林曹瑾赵玉琪张欣郝力壮简莹娜孙偲李军训宋洪宁王楠天津科技大学生物工程学院教育部工业发酵微生物学重点实验室天津300457 青海大学青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室西宁810016 青海大学畜牧兽医科学院青海省动物疾病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室西宁810016 青海百分牛生物科技有限公司西宁810016 山东泰山生力源集团股份有限公司泰安271000

本研究旨在从青海省牦牛源样品中分离筛选可用于改善牦牛腹泻的潜在益生菌菌株,并评价其体外益生特性。试验首先从健康牦牛粪便和酸奶中分离纯化出乳酸菌,通过菌落形态观察、16S rDNA以及对部分菌株进行保守基因rpoA测序,并进行BLAST比... 详细信息

本研究旨在从青海省牦牛源样品中分离筛选可用于改善牦牛腹泻的潜在益生菌菌株,并评价其体外益生特性。试验首先从健康牦牛粪便和酸奶中分离纯化出乳酸菌,通过菌落形态观察、16S rDNA以及对部分菌株进行保守基因rpoA测序,并进行BLAST比对,对筛选菌株进行鉴定。然后,通过评价菌株的生长、耐酸、耐胆盐、自动聚集能力和疏水性等特性筛选出优异菌株,重点考察其对来自腹泻致死牦牛中分离的致病菌的抑制能力,同时对其抗生素耐药性、细胞黏附能力、抗氧化能力[2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除率、羟自由基清除率及还原能力]及抗炎能力[巨噬细胞释放一氧化氮(NO)]进行测定。结果表明:试验共获得8株乳酸菌,其中1株为罗伊氏黏液乳杆菌,3株为植物乳植杆菌,4株为屎肠球菌。其中,罗伊氏黏液乳杆菌QM11具有较强的耐酸和耐胆盐能力;自动聚集率和疏水率分别为(64.07±1.36)%和(26.90±1.51)%;对牦牛源致病性大肠杆菌QH01、QH02和QH03的抑菌率分别为(87.29±0.98)%、(74.67±1.28)%和(86.43±0.21)%,对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌等多种病原指示菌的抑菌率达74%以上;对氨苄西林、青霉素、庆大霉素和链霉素等多种抗生素敏感。与对照菌株鼠李糖乳杆菌GG相比,罗伊氏黏液乳杆菌QM11对结肠细胞的黏附能力更强,黏附率为(54.38±2.15)%;菌悬液的抗氧化能力更强,DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和还原能力分别为(4.19±1.03)%、(180.29±9.28)%和(6.07±0.60)%;抑制巨噬细胞释放NO的能力与鼠李糖乳杆菌GG相当。综上所述,本试验筛选出的罗伊氏黏液乳杆菌QM11可作为后续研制用于防治牦牛腹泻益生菌制剂的备选菌株。

关键词：牦牛益生菌筛选益生特性

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青海海北地区牦牛病毒性腹泻病毒流行病学调查及5′-UTR遗传进化分析

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中国畜牧兽医 2025年第3期52卷 1241-1249页

作者：林伟山马豆豆雷萌桐魏斌李国才王光华王戈平简莹娜李秀萍青海大学畜牧兽医科学院西宁810016 青海省动物疾病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室西宁810016 青海省西宁市湟源县畜牧兽医站西宁812100

【目的】了解青海省海北地区牦牛群中牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况及遗传学分子特征。【方法】对采集自青海海北地区的148份腹泻牦牛粪便样品提取病毒RNA并反转录合成cDNA,以其为模板扩增BVDV 5′-UT... 详细信息

【目的】了解青海省海北地区牦牛群中牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况及遗传学分子特征。【方法】对采集自青海海北地区的148份腹泻牦牛粪便样品提取病毒RNA并反转录合成cDNA,以其为模板扩增BVDV 5′-UTR保守区域,建立特异性检测牦牛BVDV的实时荧光定量PCR方法,并以该方法对青海海北地区牦牛养殖场BVDV感染情况进行检测。选取4份BVDV阳性样品,对BVDV 5′-UTR区域序列进行PCR扩增和测序,与NCBI中不同亚型BVDV以及同属病毒毒株进行相似性比对,并基于BVDV 5′-UTR区域进行遗传进化分析。【结果】本研究基于BVDV 5′-UTR成功建立实时荧光定量PCR检测方法,标准曲线相关系数(R^(2))为0.997,标准品浓度为2.69×10^(2)~2.69×10^(9)拷贝/μL时具有良好的线性关系,最小检出限为2.69×10^(2)拷贝/μL。重复性试验结果显示,变异系数均<1.7%,具有良好的重复性和稳定性。采用建立的实时荧光定量PCR方法对青海省海北地区门源县、祁连县、海晏县和湟源县的腹泻牦牛粪便样品进行检测,结果显示,BVDV阳性率分别为45.00%、36.00%、30.77%和29.00%。BVDV 5′-UTR序列比对结果显示,分离获得的4株牦牛源BVDV与伊朗、美国的BVDV-1a亚型毒株聚集在同一个独立分支,核苷酸序列相似性为76.6%~99.7%。【结论】本研究明确了BVDV-1a型是导致青海省海北地区牦牛腹泻的重要病原之一,为该地区牦牛养殖场及时、有效地采取防控措施提供了科学依据,同时丰富了当地BVDV的分子流行病学调查数据,为该地区牛病毒性腹泻病的防控及疫苗研发提供了理论基础。

关键词：牦牛牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 流行病学实时荧光定量PCR 遗传进化分析

青藏高原地区分离的马副蛔虫鉴定及其遗传进化分析

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现代畜牧兽医 2025年第01期 15-19页

作者：张琴琴简莹娜才让周在张学勇刚察县畜牧兽医站青海大学畜牧兽医科学院青海省动物疾病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室刚察县沙柳河镇畜牧兽医站

研究旨在为马副蛔虫的分类、鉴定和种群遗传进化分析及分子流行病学调查等提供参考。试验对疑似马副蛔虫成虫分离株进行形态学特征观察，采用线虫cox1基因通用引物进行PCR扩增并测序；并以马副蛔虫线粒体cox1和nad1特异性基因引物进一... 详细信息

研究旨在为马副蛔虫的分类、鉴定和种群遗传进化分析及分子流行病学调查等提供参考。试验对疑似马副蛔虫成虫分离株进行形态学特征观察，采用线虫cox1基因通用引物进行PCR扩增并测序；并以马副蛔虫线粒体cox1和nad1特异性基因引物进一步开展PCR扩增并测序。将两个基因测序结果与GenBank登录的马副蛔虫的相应基因序列比对分析其同源性，并构建进化树分析遗传进化关系。结果显示，分离虫株为大型虫体，虫体长约19 cm，虫体近似圆柱形，两端较细，黄白色，口孔周围有3片唇。经过PCR扩增在450 bp左右出现目的条带，且该基因序列与马副蛔虫cox1基因序列的同源性高达98.0%。初步表明该线虫属于马副蛔虫。PCR结果显示，分别扩增到约1 052 bp (cox1)和660 bp (nad1)的目的条带。同源性分析结果显示，两个目的基因序列与GenBank记录的马副蛔虫相应的基因序列的同源性分别高达99.69%和99.51%。进化树结果显示，该虫株的两个基因均与不同宿主的马副蛔虫处于同一分支。研究表明，试验成功鉴定了分离到的线虫为马副蛔虫成虫，并分析其线粒体基因同源性及遗传演化关系，为马副蛔虫的分类、鉴定和种群遗传进化分析及分子流行病学调查等奠定了研究基础。

关键词：马副蛔虫线虫鉴定遗传进化

基于P48重组蛋白的牛支原体抗体检测技术研究

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基于P48重组蛋白的牛支原体抗体检测技术研究

作者：简莹娜中国农业科学院

学位级别：硕士

牛支原体(Mycoplasma bovis,***)是感染牛的一种致病性病原体,主要引起牛乳腺炎、肺炎、关节炎、中耳炎,也可引起角膜炎、结膜炎等疾病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。2008年,我国首次报道了***引起的犊牛传染性肺炎,并造成了很大... 详细信息

牛支原体(Mycoplasma bovis,***)是感染牛的一种致病性病原体,主要引起牛乳腺炎、肺炎、关节炎、中耳炎,也可引起角膜炎、结膜炎等疾病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。2008年,我国首次报道了***引起的犊牛传染性肺炎,并造成了很大损失。目前,牛支原体感染已成为危害我国养牛业的重要疾病之一。但我国迄今尚无特异、敏感的***抗体检测试剂,缺乏有效的流行病学技术手段,这给牛支原体病的预防控制带来了困难。本研究利用牛支原体P48重组蛋白,建立了检测***抗体的间接血凝试验方法和胶体金免疫层析试纸条,并完成了试剂盒组装、实验室试制和质量研究,为牛支原体病的诊断和流行病学调查提供了有效工具,对本病的预防控制具有重要意义。本研究第一部分为***抗体的间接血凝试验方法和胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立。在参考文献的基础上,优化并合成牛支原体的p48基因,克隆到p ET32a(+)表达载体上后,转化大肠杆菌BL21(DE3),16℃低温长时间诱导,获得部分可溶性表达的P48重组蛋白。经Western-blot检测,纯化的P48重组蛋白能与***高免血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。以纯化的P48重组蛋白致敏醛化-鞣酸化的绵羊红细胞,建立了检测牛支原体抗体的间接血凝试验方法(IHA)。P48重组蛋白致敏红细胞的最佳浓度是200μg/m L,***高免血清抗体效价达1:211。该方法对牛肺疫、牛巴氏杆菌病、牛病毒性腹泻病、布氏杆菌病、结核病、口蹄疫、牛生殖道支原体感染、里奇氏支原体感染、大肠杆菌病阳性血清检测均为阴性。分析特异性为100%,分析敏感性为93.33%。与国外商品化的ELISA试剂盒比较,平均符合率为96.15%。对833份田间血清和1084份乳清进行检测,阳性率分别是15.37%和19.56%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强和重复性好,可用于牛支原体抗体水平检测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学调查。利用合适粒径的胶体金颗粒在p H7.4条件下标记6μg/m L P48重组蛋白作为金标抗原包被金标垫、山羊抗牛Ig G(H+L)二抗包被检测线(T线)、兔抗P48重组蛋白Ig G多抗包被质控线(C线),组装成胶体金免疫层析试纸条(ICS)。该试纸条检测***高免血清,效价可至1:106。检测上述相近病原或者类症病原阳性血清,不发生交叉反应。与IHA方法相比,阳性符合率为93.57%,阴性符合率为93.02%,平均符合率为96.53%。检测临床血清200份,乳清108份,阳性率分别是21.50%、17.59%。结果表明该试纸条敏感、特异、快速,适合于牛支原体抗体的快速检测。本研究第二部分依据农业部683号公告对两种方法进行实验室试制和质量研究。建立了生产试剂盒用的种子批,规范了阴、阳性对照血清的制备和检验方法,并试制了两种试剂各3批。对3批试剂分别进行了敏感性、特异性、重复性和保存期试验,结果实验室试制的两种试剂质量稳定,检测结果可靠,为下一步申报新兽药证书积累了实验数据。

关键词：牛支原体 P48重组蛋白抗体检测间接血凝试验方法胶体金免疫层析试纸条

基于重组酶介导等温扩增技术的3种棘球绦虫核酸检测方法的建立及初步应用

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中国血吸虫病防治杂志 2021年第4期33卷 339-345页

作者：张学勇简莹娜郭志宏朵红魏彦明甘肃农业大学动物医学院兰州730070 青海大学畜牧兽医科学院

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法分别以多房棘球绦虫(GenB... 详细信息

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法分别以多房棘球绦虫(GenBank登录号:NC 000928)、细粒棘球绦虫(GenBank登录号:NC044548)和石渠棘球绦虫(GenBank登录号:NC009460)线粒体基因组序列为靶序列,依据RAA引物设计基本原则设计、合成3对引物,并进行多重RAA扩增。分别扩增不同浓度3种棘球绦虫基因组DN A和不同浓度含3种靶基因的重组质粒,以评价多重RAA检测方法的敏感性;同时采用该方法检测3种棘球绦虫及多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫基因组DNA,以评价该方法的特异性。优化建立的多重RAA法的条件,再检测棘球蚴病病变组织样本、模拟犬粪便样本和现场狐狸粪便样本,以评价该方法的应用价值。结果所建立的多重RAA检测方法可在39℃时40 min内特异性扩增多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫线粒体基因片段,长度分别约为540、430 bp和200 bp。该多重RAA法对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA的最低检测限为2.0、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,对含多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫靶基因的重组质粒的最低检测限均可达到200拷贝/μL;该多重RAA法可以同时检测出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫单一感染和多重感染,对多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫无扩增。优化后的多重RAA法能够检测出全部棘球蚴病病变组织样本及模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品,且与单一PCR法检测结果完全一致。结论成功建立了一种可用于多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DN A快速检测的多重RAA法,特异性和敏感性均较高。

关键词：多房棘球绦虫细粒棘球绦虫石渠棘球绦虫重组酶介导的等温扩增技术多重核酸检测

山羊支原体山羊肺炎亚种单克隆抗体的制备及抗体结合抗原表位的筛选

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中国畜牧兽医 2014年第8期41卷 21-24页

作者：郑莹莹骈亚亚储岳峰赵萍贺英简莹娜姜永强逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

本研究旨在制备山羊支原体山羊肺炎亚种(***,Mccp)的单克隆抗体并筛选与抗体结合的抗原表位。试验用甲醛灭活的Mccp免疫BALB/c小鼠,运用传统的细胞融合技术进行融合获得杂交瘤细胞,亚克隆,制备单克隆抗体腹水,采用酶联免疫技术(ELISA)... 详细信息

本研究旨在制备山羊支原体山羊肺炎亚种(***,Mccp)的单克隆抗体并筛选与抗体结合的抗原表位。试验用甲醛灭活的Mccp免疫BALB/c小鼠,运用传统的细胞融合技术进行融合获得杂交瘤细胞,亚克隆,制备单克隆抗体腹水,采用酶联免疫技术(ELISA)和免疫印迹(Western blotting)技术鉴定单克隆抗体的特异性及胶内酶切鉴定与抗体结合的抗原表位。最终成功筛选获得5株单克隆抗体,鉴定到3个与抗体结合的抗原表位,为下一步科学研究提供了初步且可靠的试验基础。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种单克隆抗体抗体结合的抗原表位

牛支原体P48蛋白的表达及间接血凝检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2015年第3期45卷 241-246页

作者：简莹娜储岳峰赵萍陈胜利贺英秦明明潘玮玮刘永生逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

优化并合成牛支原体的p48基因,将其克隆到pET-32a(+)表达载体上后,转化大肠杆菌BL21(DE3),16℃低温诱导表达,获得可溶性表达的大小约66ku的重组P48蛋白。将纯化后的重组P48蛋白致敏戊二醛和鞣酸处理过的绵羊红细胞,建立了检测牛支原体... 详细信息

优化并合成牛支原体的p48基因,将其克隆到pET-32a(+)表达载体上后,转化大肠杆菌BL21(DE3),16℃低温诱导表达,获得可溶性表达的大小约66ku的重组P48蛋白。将纯化后的重组P48蛋白致敏戊二醛和鞣酸处理过的绵羊红细胞,建立了检测牛支原体抗体的间接血凝试验。重组P48蛋白致敏红细胞的最佳质量浓度是20~40μg/mL,牛支原体超免疫血清抗体效价达1∶2 048~1∶4 096。该方法对牛肺疫、牛巴氏杆菌病、牛病毒性腹泻病、布氏杆菌病、结核病、口蹄疫、牛生殖道支原体感染、里奇氏支原体感染、大肠杆菌病阳性血清的检测结果均为阴性。该方法的特异性为100%,敏感性为93.33%。与国外商品化的牛支原体ELISA试剂盒相比,平均符合率为96.15%。对833份田间血清和1 084份乳清进行检测,阳性率分别是15.37%和19.56%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强和重复性好,可用于牛支原体抗体水平检测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学调查。

关键词：牛支原体重组P48蛋白可溶性表达间接血凝试验抗体检测