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辣椒疫霉菌PiAvr3a-like基因的鉴定及功能分析

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植物病理学报 2016年第2期46卷 160-168页

作者：许静张美祥叶廷跃沈丹宇窦道龙南京农业大学植物保护学院植物病理系南京210095

疫霉菌分泌的RxLR效应子能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能。我们通过同源序列搜索在辣椒疫霉菌中鉴定到9个PiAvr3a的同源基因(PiAvr3a-like),同时发现PiAvr3a-like在大豆疫霉菌中也有分布,表明该类基因可能在疫霉菌致病过程中发... 详细信息

疫霉菌分泌的RxLR效应子能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能。我们通过同源序列搜索在辣椒疫霉菌中鉴定到9个PiAvr3a的同源基因(PiAvr3a-like),同时发现PiAvr3a-like在大豆疫霉菌中也有分布,表明该类基因可能在疫霉菌致病过程中发挥重要作用。从辣椒疫霉菌中成功克隆了5个PiAvr3a-like基因,表达模式分析发现PcAvh128/132/134这3个基因在疫霉菌侵染早期诱导表达,暗示它们可能在侵染前期发挥功能。接种实验表明在本氏烟中瞬时表达其中的PcAvh128可以显著促进辣椒疫霉菌的侵染,而PcAvh132活性相反,其他3个基因没有明显活性。这5个基因均不能抑制INF1和效应因子诱导的细胞死亡,也不能诱导可见的过敏反应。上述结果表明PiAvr3a-like基因不同成员之间功能存在分化,这为疫霉菌和寄主的分子互作研究提供了材料和参考。

关键词：辣椒疫霉菌 PiAvr3a PiAvr3a-like 毒性细胞死亡

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生产药物蛋白的替代方法仍在缓慢发展

生物技术通报 2002年第6期18卷 42-43页

作者：王旭静窦道龙

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作物疫病菌效应子研究进展与育种应用探索

作物疫病菌效应子研究进展与育种应用探索

2016年全国植物生物学大会

作者：窦道龙王源超南京农业大学植保学院

疫霉属(Phytophthora)病原菌有120余种,寄主广,所致病害蔓延速度快且易爆发成灾,因此生产上将其统称为作物"疫病"。在互作过程中疫霉菌产生近千种效应子,它们不但是侵染寄主引起病害的重要武器,而且能被寄主抗病基因识别诱导抗病,还能...

疫霉属(Phytophthora)病原菌有120余种,寄主广,所致病害蔓延速度快且易爆发成灾,因此生产上将其统称为作物"疫病"。在互作过程中疫霉菌产生近千种效应子,它们不但是侵染寄主引起病害的重要武器,而且能被寄主抗病基因识别诱导抗病,还能通过分子变异逃脱识别导致作物抗病性丧失和病害爆发成灾,因此研究其功能与作用机制有助于揭示病原菌致病和植物抗病机理,开发病害控制新技术。我们将汇报以下几个方面的研究进展:1.疫霉菌效应子的转运途径与机理。疫霉菌有Rx LR和CRN两类效应子在寄主胞内起作用,其

关键词：

来源： cnki会议评论

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大豆疫霉细胞凋亡相关基因的鉴定与表达分析

植物保护学报 2018年第4期45卷 812-818页

作者：陈琳琳耿雪晶王雯张雄窦道龙李洪连河南农业大学植物保护学院小麦玉米作物学国家重点实验室河南省粮食作物协同创新中心郑州450002 南京农业大学植物保护学院南京210095

为探讨大豆疫霉Phytophthora sojae细胞凋亡潜在的调控机制,根据已知的细胞凋亡蛋白,利用在线工具BLASTP、pFAM和SMART在大豆疫霉蛋白组数据库中鉴定细胞凋亡同源蛋白并构建其进化树,通过转录组数据和实时荧光定量PCR技术分析细胞凋亡... 详细信息

为探讨大豆疫霉Phytophthora sojae细胞凋亡潜在的调控机制,根据已知的细胞凋亡蛋白,利用在线工具BLASTP、pFAM和SMART在大豆疫霉蛋白组数据库中鉴定细胞凋亡同源蛋白并构建其进化树,通过转录组数据和实时荧光定量PCR技术分析细胞凋亡相关基因在大豆疫霉生长、发育及侵染不同时期的表达情况。结果显示:在大豆疫霉中共鉴定到13个细胞凋亡同源蛋白,包括核酸内切酶G(PsNUC1)、细胞色素c(PsCYCS)、凋亡诱导因子(PsAIF)、丝氨酸蛋白酶(PsHtrA-1、PsHtrA-2和PsHtrA-3)、多聚ADP核糖聚合酶(PsPARP-1、PsPARP-2和PsPARP-3)和TatD核酸酶(PsTatD1、PsTatD2、PsTatD3和PsTatD4)。在进化上,PsNUC1、PsCYCS、PsAIF、PsHtrA-1、PsPARP-1、PsPARP-2、PsPARP-3、PsTatD1和PsTatD2与人及秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的同源蛋白亲缘关系较近,而与真菌相关蛋白亲缘关系较远,PsHtrA-2、PsHtrA-3、PsTatD3和PsTatD4与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae相关蛋白相似度更高,说明大豆疫霉细胞凋亡蛋白在进化中发生了较大变异。大豆疫霉细胞凋亡相关基因PsHtrA-1和PsRARP-1在孢子囊阶段诱导表达,PsHtrA-2和PsRARP-2在游动孢子阶段上调表达,PsAIF、PsHtrA-3、PsRARP-1和PsRARP-2在侵染阶段明显诱导表达,PsCYCS在侵染阶段下调表达。细胞凋亡相关基因在大豆疫霉不同阶段的表达模式有较大差异,说明细胞凋亡在大豆疫霉生长、发育及致病过程中具有重要作用。

关键词：大豆疫霉细胞凋亡基因鉴定表达分析

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人溶菌酶基因在烟草中的表达

农业生物技术学报 2002年第4期10卷 338-342页

作者：王冰山窦道龙张永强张猛王志兴贾士荣西北农林科技大学园艺系北京 100093 杨凌 712100 中国农业科学院生物技术研究所北京 100081 中国科学院植物研究所中国农业科学院生物技术研究所

根据植物偏爱的密码子,改变G+C总量和密码子第三位碱基的G+C含量,同时避免在真核表达中影响转录、翻译及mRNA稳定性的序列如AATTAAA和ATTTA,在原氨基酸序列不变的基础上,设计并合成了适合在植物中高效表达的人溶菌酶(human lysozyme,简... 详细信息

根据植物偏爱的密码子,改变G+C总量和密码子第三位碱基的G+C含量,同时避免在真核表达中影响转录、翻译及mRNA稳定性的序列如AATTAAA和ATTTA,在原氨基酸序列不变的基础上,设计并合成了适合在植物中高效表达的人溶菌酶(human lysozyme,简称HL)基因。构建了含HL基因的植物表达载体。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将其转化烟草(Nicotiana tabacum)。PCR和Western检测表明,HL基因在转基因烟草中得到整合和表达。提高了转基因烟草离体叶对野火(Pseudomonas syringae ***)的抗性。

关键词：人溶菌酶基因烟草表达

在中国大豆品种上创建ALSV诱导的基因沉默体系

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中国农业科学 2022年第9期55卷 1710-1722页

作者：董永鑫卫其巍洪浩黄莹赵延晓冯明峰窦道龙徐毅陶小荣南京农业大学植物保护学院/农业农村部大豆病虫害防控重点实验室四川省达州市农业科学研究院

【目的】在中国大豆品种上建立以苹果潜隐球形病毒（apple latent spherical virus,ALSV）为载体的基因沉默体系，为中国大豆品种的基因功能和遗传育种提供一种简便、省时、易操作的技术体系。【方法】构建以农杆菌介导接种的ALSV病毒... 详细信息

【目的】在中国大豆品种上建立以苹果潜隐球形病毒（apple latent spherical virus,ALSV）为载体的基因沉默体系，为中国大豆品种的基因功能和遗传育种提供一种简便、省时、易操作的技术体系。【方法】构建以农杆菌介导接种的ALSV病毒侵染性克隆载体。从大豆品种威廉姆斯82(Williams 82)中特异扩增327 bp的八氢番茄红素脱氢酶（GmPDS）基因cDNA片段，插入病毒载体pALSV2。通过农杆菌浸润法将病毒载体导入模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）,17 d后富集病毒粒子，摩擦接种大豆第一轮真叶，以接种病毒空载作为对照组，持续观察测试大豆植株系统叶表型，并结合逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ALSV衣壳蛋白基因（CP）和GmPDS的表达水平。【结果】ALSV﹕GmPDS接种大豆品种威廉姆斯82和南农1138-2,20 d后，前者系统叶未见白化表型，而后者系统叶出现明显的白化表型；qRT-PCR检测结果表明，发生白化的南农1138-2植株中GmPDS的表达水平显著降低，未出现白化表型的威廉姆斯82中GmPDS的表达水平没有出现显著变化。在此基础上，采用相同的方法，测试了ALSV在其他9种大豆品种中诱导GmPDS的沉默效率，发现在南农47、安豆203、祥斗4号、中黄13、山宁29、齐黄34等大豆品种上接种ALSV﹕GmPDS后植株系统叶均产生白化表型，而菏豆12、中黄311和山宁16等3个品种的GmPDS均不能诱导有效沉默。【结论】构建了农杆菌介导的ALSV病毒载体，利用本氏烟扩繁富集ALSV病毒，将提纯的病毒粒体摩擦接种大豆真叶，在多个中国大豆品种上成功建立了基因沉默体系。

关键词：病毒诱导的基因沉默大豆苹果潜隐球形病毒大豆八氢番茄红素脱氢酶基因

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基于环介导等温扩增技术快速检测瓜果腐霉菌

南京农业大学学报 2018年第1期41卷 79-87页

作者：李庆玲沈丹宇于佳赵媛媛朱也窦道龙南京农业大学植物保护学院江苏南京210095

[目的]建立一种快速、准确的检测瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为诊断和防治瓜果腐霉菌引起的植物病害提供技术支撑。[方法]通过比较基因组学方法,在瓜果腐... 详细信息

[目的]建立一种快速、准确的检测瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为诊断和防治瓜果腐霉菌引起的植物病害提供技术支撑。[方法]通过比较基因组学方法,在瓜果腐霉菌基因组上筛选有序列特异性的基因作为检测的靶标基因,设计LAMP特异性引物,建立一种基于颜色判定的快速、准确的LAMP检测方法,随后对该检测方法的特异性、灵敏度和发病组织实际检测等进行分析评价。[结果]鉴定到1个编码Trypsin蛋白酶的基因是瓜果腐霉菌特异的基因,以该序列作为靶标建立了LAMP检测方法。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为指示剂,在等温条件(64℃)下进行核酸扩增反应60 min,即可通过肉眼直接观察结果,HNB显示天蓝色即为阳性反应;同时,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。特异性试验中,建立的LAMP检测方法能将瓜果腐霉菌和其他病原菌区分开。灵敏度试验中,LAMP检测方法的最低检测限为100 pg·μL-1,与Real-time PCR反应灵敏度一样,是普通PCR反应灵敏度的100倍。发病组织实际检测试验中,该LAMP方法能检测出人工接种发病植株中的瓜果腐霉菌。[结论]成功建立了一种适用于基层使用的针对瓜果腐霉菌的快速检测技术,为该菌所致病害的准确诊断奠定了技术基础。

关键词：瓜果腐霉菌环介导等温扩增快速检测羟基萘酚蓝(HNB)

大豆疫霉效应因子PsCRN115诱导烟草抗性的机制分析

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南京农业大学学报 2012年第4期35卷 65-68页

作者：刘廷利茹艳艳刘莉刘沛菡窦道龙南京农业大学植物保护学院/农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室江苏南京210095

CRN(crinkling and necrosis induced protein)蛋白是卵菌所特有的一类效应因子,在已经测序的疫霉种中,每个基因组中预测都含有上百个CRN基因,关于其功能和分子机制目前研究不多。前期研究发现,大豆疫霉效应因子PsCRN115是大豆疫霉的致... 详细信息

CRN(crinkling and necrosis induced protein)蛋白是卵菌所特有的一类效应因子,在已经测序的疫霉种中,每个基因组中预测都含有上百个CRN基因,关于其功能和分子机制目前研究不多。前期研究发现,大豆疫霉效应因子PsCRN115是大豆疫霉的致病性必需因子且能抑制植物的细胞死亡。为了进一步研究PsCRN115的功能,本研究采用农杆菌渗入法介导的基因瞬时转化技术在烟草上过表达该基因,发现PsCRN115可显著提高烟草对烟草疫霉的抗性。随后采用荧光定量PCR研究了其作用机制,发现PsCRN115可诱导水杨酸(SA)通路防卫反应基因的高表达,但对乙烯(ET)和茉莉酸(JA)通路防卫反应基因的表达影响不显著。表明:大豆疫霉效应因子PsCRN115是致病必需的因子,能被植物所识别,并诱导植物的防卫反应。

关键词：大豆疫霉效应因子烟草抗性防卫反应

效应因子PsCRN77基因在本氏烟中的表达降低其对寄生疫霉的抗性

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植物病理学报 2015年第6期45卷 619-625页

作者：张美祥刘廷利茹艳艳张琪梦窦道龙南京农业大学植物保护学院南京210095

CRN(Crinkler)是一类疫霉菌胞内效应因子,绝大多数CRN的功能和作用机制尚不明确。本研究利用农杆菌介导的瞬时表达技术,发现大豆疫霉效应因子PsC RN77可以在本氏烟中抑制激发子诱导的细胞死亡。接种分析表明在本氏烟中表达该效应因子基... 详细信息

CRN(Crinkler)是一类疫霉菌胞内效应因子,绝大多数CRN的功能和作用机制尚不明确。本研究利用农杆菌介导的瞬时表达技术,发现大豆疫霉效应因子PsC RN77可以在本氏烟中抑制激发子诱导的细胞死亡。接种分析表明在本氏烟中表达该效应因子基因可以促进寄生疫霉的侵染。定量RT-PCR结果显示在本氏烟中表达PsCRN77可以负调控水杨酸信号途径标记基因PRb-1b的表达,正调控茉莉酸信号途径标记基因LOX的表达。进一步通过DAB染色表明,与表达GFP对照相比,表达PsCRN77可以降低疫霉菌侵染后本氏烟中的活性氧积累。以上结果表明PsCRN77是一个毒性效应因子,可以通过影响激素抗性信号途径和活性氧积累干扰植物的防卫反应,促进病原菌的侵染。该研究为认识疫霉菌的致病机制提供了线索。

关键词：效应因子 CRN 细胞死亡毒性免疫反应