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乳腺重构的过程及其调节因素

生物化学与生物物理进展 2021年第12期48卷 1456-1462页

作者：伍超群刘建新石恒波浙江大学动物科学学院奶业科学研究所杭州310058

受到妊娠周期的影响,乳腺组织在雌性哺乳动物一生中经历着妊娠-哺乳-退化的周期性发育变化.在乳腺退化到再次泌乳的过程中,乳腺细胞经历凋亡和更新,从而实现乳腺组织的自我更新和修复,即乳腺重构.重构期间乳腺在组织结构和生理过程中发... 详细信息

受到妊娠周期的影响,乳腺组织在雌性哺乳动物一生中经历着妊娠-哺乳-退化的周期性发育变化.在乳腺退化到再次泌乳的过程中,乳腺细胞经历凋亡和更新,从而实现乳腺组织的自我更新和修复,即乳腺重构.重构期间乳腺在组织结构和生理过程中发生显著变化,但该过程物种间差异较大.乳用家畜为维持泌乳,妊娠期和干奶期重叠,展示出独特的再生性乳腺重构.再生性乳腺重构对乳畜乳腺健康和下一周期的泌乳具有重要意义,研究此过程将为后续调控乳腺自我更新和改善乳腺健康提供思路.本综述总结了近年来动物乳腺重构的研究进展,系统归纳了影响乳腺重构的因素,包括激素、蛋白酶、细胞因子、热应激、氧化应激、光照周期等,旨在解析乳腺重构的生理机制,为精准调控该过程提供科学依据.

关键词：乳腺重构健康细胞更新氧化应激

奶山羊SCD基因CDS区的克隆、序列分析及过表达

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中国农业科学 2012年第24期45卷 5091-5101页

作者：石恒波罗军朱越王紫骞赵旺生西北农林科技大学动物科技学院/陕西省农业分子生物学重点实验室

【目的】研究奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl-CoA desaturase,SCD)在乳腺上皮细胞中对不饱和脂肪酸合成过程相关基因的调控及对细胞脂肪酸组成的影响。【方法】用RT-PCR方法从西农萨能羊乳腺组织中扩增SCD基因,进行序列分析和... 详细信息

【目的】研究奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl-CoA desaturase,SCD)在乳腺上皮细胞中对不饱和脂肪酸合成过程相关基因的调控及对细胞脂肪酸组成的影响。【方法】用RT-PCR方法从西农萨能羊乳腺组织中扩增SCD基因,进行序列分析和组织表达谱分析;构建重组腺病毒质粒,进行包装和扩增后,感染体外培养的奶山羊原代乳腺上皮细胞,实时定量检测相关基因的表达,western blotting检测蛋白变化,气相色谱-质谱联用分析细胞内脂肪酸组成变化。【结果】①获得了全长1 080 bp的山羊乳腺SCD基因CDS(GenBank登录号:GU947654)并对其进行了生物信息学分析;②奶山羊SCD基因在乳腺、肺和皮下脂肪组织中高表达,而在心脏、瘤胃和卵巢组织中的表达量较低;③成功构建了奶山羊SCD基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒液,重组腺病毒感染原代乳腺上皮细胞后,检测结果表明细胞中SCD基因过表达极显著,FASN、H-FABP、LEPR和LXRα等基因表达下调,而PPARγ和LPL基因的表达量显著性增加;④棕榈酸和硬脂酸的含量下降,不饱和脂肪酸含量上升。【结论】SCD基因在奶山羊乳腺中发挥着重要作用,FASN、H-FABP、LEPR、LXRα、PPARγ和LPL基因的表达与其相关,这些基因共同影响乳脂中脂肪酸的组成。

关键词：奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶乳腺上皮细胞腺病毒过表达

山羊SREBP-1基因的超表达对脂肪酸代谢相关基因表达的影响

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生物工程学报 2012年第11期28卷 1306-1316页

作者：许会芬罗军李芳余康石恒波李君林先滋朱江江西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室陕西杨凌712100

本研究旨在通过构建西农萨能羊固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)基因的重组腺病毒超表达载体,获得有感染性的病毒颗粒,并检测该基因过表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响,为进一步研究该基因在脂肪酸代谢及泌乳调控中的功... 详细信息

本研究旨在通过构建西农萨能羊固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)基因的重组腺病毒超表达载体,获得有感染性的病毒颗粒,并检测该基因过表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响,为进一步研究该基因在脂肪酸代谢及泌乳调控中的功能奠定基础。根据GenBank中收录的西农萨能羊SREBP-1基因的序列设计引物,PCR扩增后进行测序。将测序正确的目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后并进行线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌Escherichia coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组,将重组成功的质粒进行PacⅠ酶线性化,转染HEK 293细胞进行重组腺病毒的包装、扩繁及滴度测定。病毒液感染原代乳腺上皮细胞,实时荧光定量检测SREBP-1超表达效果及对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明:重组腺病毒质粒构建成功,腺病毒滴度为109U/mL。病毒液感染乳腺上皮细胞48 h后,SREBP-1基因表达量上升大约15倍,72 h后,表达量上调了30倍;对脂肪酸代谢相关基因的影响在72 h较为明显,其中,脂肪酸合酶(FASN)及酰基辅酶A羧化酶(ACC)均显著上调了大约两倍,过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)上调了大约1.5倍,肝素X受体(LXRα)及甘油三酯水解酶(ATGL)表达量升高了1.2倍;其中硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)表达水平无明显变化。表明在西农萨能羊乳腺上皮细胞中,SREBP-1能够促进脂肪酸合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂肪酸代谢具有调控作用。

关键词：山羊 SREBP-1 超表达脂肪酸合成

关键转录因子调节反刍动物乳腺脂肪酸代谢的研究进展

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农业生物技术学报 2020年第5期28卷 918-924页

作者：辛慧杰刘建新石恒波浙江理工大学生命科学与医药学院浙江大学动物科学学院奶业科学研究所

脂肪含量是乳品质的重要评价指标。除了作为能量供应,反刍动物乳中脂肪对于人类的健康有着重要的生理作用,而反刍动物乳腺中脂肪的代谢受到核转录因子的调控。近年来,核转录因子调节反刍动物乳腺脂肪酸代谢的研究取得了重要进展,尤其是... 详细信息

脂肪含量是乳品质的重要评价指标。除了作为能量供应,反刍动物乳中脂肪对于人类的健康有着重要的生理作用,而反刍动物乳腺中脂肪的代谢受到核转录因子的调控。近年来,核转录因子调节反刍动物乳腺脂肪酸代谢的研究取得了重要进展,尤其是配体依赖性转录因子过氧化物酶增殖物激活受体家族(peroxisome proliferator-activated receptor family, PPAR)和肝X受体(liver X receptor, LXR)对乳腺脂肪酸合成的决定性作用得到证实。PPAR和LXR均能形成转录复合体,结合下游靶基因的启动子上游,继而影响乳脂代谢相关通路的活性。PPAR和LXR不同的基因亚型的生理功能存在较大差异。胆固醇应答元件结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein 1, SREBP1)是调节乳腺脂肪酸合成的典型转录因子,主要影响脂肪酸的重头合成等。本文对这些关键转录因子调节乳腺脂肪酸合成的最新研究进展进行综述,旨在为调控乳脂成分提供参考资料。

关键词：转录因子脂肪酸乳腺调控

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不同蛋白水平对西农萨能羊泌乳性能的影响

中国畜牧杂志 2012年第17期48卷 48-50页

作者：张犁苹罗军王慧朱江江石恒波西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

本试验旨在探求西农萨能羊饲料中最合适的蛋白水平,以充分发挥奶山羊的泌乳性能、提高山羊的奶品质。试验采用单因素试验设计,选择处于泌乳盛期体重、胎次、泌乳量接近的健康西农萨能羊,随机分成3组,每组11只。固定能量水平为12.51 MJ/k... 详细信息

本试验旨在探求西农萨能羊饲料中最合适的蛋白水平,以充分发挥奶山羊的泌乳性能、提高山羊的奶品质。试验采用单因素试验设计,选择处于泌乳盛期体重、胎次、泌乳量接近的健康西农萨能羊,随机分成3组,每组11只。固定能量水平为12.51 MJ/kgDM,蛋白水平分别为10%、14%和18%。试验期共100 d,预试期10 d,正试期90 d。结果表明:随着试验的进行,各组产奶量呈下降趋势,10%蛋白水平组下降幅度最大,14%蛋白组次之,18%蛋白组下降幅度最小;各试验组乳成分分析表明,18%蛋白组中乳脂、乳糖和全脂固形物降低幅度最明显,10%蛋白组降低幅度次之,14%蛋白组降低幅度最小。本试验中同等能量水平,不同蛋白水平对奶山羊产奶量和乳成分影响差异不显著(P>0.05)。

关键词：能量蛋白质泌乳性能西农萨能羊

奶山羊LXRα基因shRNA序列的筛选及腺病毒载体的构建与鉴定

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2011年第11期39卷 41-47,52页

作者：钟瑜罗军王维胡仕良李君孙雨婷郝娟石恒波西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室陕西杨凌712100

【目的】构建针对奶山羊肝脏X受体α(Liver X receptorα,LXRα)基因的干扰腺病毒载体。【方法】根据奶山羊LXRα基因CDS区域设计小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),分别构建pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA及pDsRed1/C1-LXRα载体,共转染HEK 293细胞,48h后观察其荧光蛋白表达量,筛选出具有明显干扰效应的shRNA。将具有明显干扰效应的shRNA载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST在LR ClonaseTMⅡ重组酶的作用下进行重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后获得重组腺病毒载体。将构建好的重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK 293细胞,培养7～10d后收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液,反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,测定其病毒滴度。【结果】①设计出了shRNA-490、shRNA-496、shRNA-509和shRNA-923 4条shRNA序列;②得到shRNA-490和shRNA-923 2条具有明显干扰效应的shRNA;③获得pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-490和pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-923 2个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切及测序结果均正确,2个腺病毒重组载体滴度均为5×108 PFU/mL。【结论】奶山羊LXRα基因重组shRNA腺病毒载体构建成功,为利用RNA干扰技术研究LXRα基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定了基础。

关键词：肝脏X受体α RNA干扰腺病毒载体奶山羊

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奶山羊成肌细胞体外分离培养及鉴定

农业生物技术学报 2018年第11期26卷 1996-2002页

作者：吕明罗军石恒波田慧彬王平西北农林科技大学动物科技学院浙江理工大学生命科学学院

成肌细胞(myoblast)具有自我更新和多向分化的能力,对骨骼肌的再生和修复起着重要作用。为了建立奶山羊(Capra hircus)肌细胞的体外分离纯化、培养和鉴定的方法,了解其增殖和成肌特性,为奶山羊肌肉发育调控机理研究提供实验材料,本研究... 详细信息

成肌细胞(myoblast)具有自我更新和多向分化的能力,对骨骼肌的再生和修复起着重要作用。为了建立奶山羊(Capra hircus)肌细胞的体外分离纯化、培养和鉴定的方法,了解其增殖和成肌特性,为奶山羊肌肉发育调控机理研究提供实验材料,本研究采集西农萨能奶山羊羔羊骨骼肌组织,采用I型胶原酶和胰酶两步酶消化法分离细胞,结合差速贴壁纯化得到成肌细胞,利用qRT-PCR和免疫荧光染色法对分离纯化后的成肌细胞进行进一步鉴定。细胞形态学观察结果显示,分离纯化后的成肌细胞呈梭形,生长状态良好;qRT-PCR和免疫荧光染色结果显示,生肌调节因子5(myogenic regulatory factor5, Myf5)和成肌决定因子(myogenic differentiation factor, MyoD)、结蛋白(desmin)呈阳性表达,纯化后的成肌细胞纯度大于95%;诱导分化后的成肌细胞能够相互融合形成肌管,成肌特异性标志蛋白肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MYHC)呈阳性表达。本研究建立了奶山羊成肌细胞体外分离培养的方法,并成功获得了高纯度的具有增殖和成肌特性的成肌细胞,可用于奶山羊肌肉发育调控研究。

关键词：奶山羊成肌细胞分离鉴定

西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2014年第12期42卷 1-6,12页

作者：李芳罗军许会芬石恒波朱江江西北农林科技大学动物科技学院农业生物技术实验室陕西杨凌712100

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠... 详细信息

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。

关键词：奶山羊MAT基因原核表达亲和纯化多克隆抗体

奶山羊间性个体的遗传鉴定及AFLP指纹图谱分析

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2013年第4期41卷 1-6页

作者：石恒波罗军王维许会芬朱江江李君西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室陕西杨凌712100

【目的】分析奶山羊间性个体的遗传背景,探讨间性个体发生的遗传机制,为山羊性别调控以及性别决定的研究提供参考。【方法】通过核型分析、特异性性别调控基因(Sex-determining region of Y chromosome,SRY)的PCR扩增以及AFLP(Amplified... 详细信息

【目的】分析奶山羊间性个体的遗传背景,探讨间性个体发生的遗传机制,为山羊性别调控以及性别决定的研究提供参考。【方法】通过核型分析、特异性性别调控基因(Sex-determining region of Y chromosome,SRY)的PCR扩增以及AFLP(Amplified fragment length polymorphism)指纹图谱分析等方法,研究西农萨能羊间性个体的遗传本质。【结果】间性山羊与正常母山羊的核型一致,为58+XX;间性个体基因组中未能扩增出SRY基因;AFLP指纹图谱分析发现,有9对引物扩增出清晰的条带,共1 833条,片段长度为70～500bp,9对引物的扩增结果差异明显,表现出丰富的多态性,共获得611个多态位点,占总扩增条带数的33.3%,但在基因组水平上间性山羊与正常母山羊个体并没有大的差异。【结论】根据试验结果推测,间性山羊的出现并非是由个体基因组发生突变造成的,可能是在性别决定过程中某个因子的调控出现差错,从而导致胚胎在发育过程中偏离雌性轨道而产生间性山羊个体,其具体机制有待进一步研究。

关键词：间性山羊核型分析 SRY基因 AFLP指纹图谱