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猪流行性腹泻病毒非结构蛋白Nsp15互作宿主蛋白的筛选及鉴定

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生物工程学报 2024年

作者：孙金磊于瑞明张莉萍张中旺王永录潘丽张全伟刘新生甘肃农业大学生命科学技术学院中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室

为了筛选和鉴定与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)非结构蛋白15 (non-structural protein 15， Nsp15)互作的关键宿主蛋白。通过IP/pull down beads结合质谱技术筛选、鉴定与PEDV非结构蛋白Nsp15互作的宿主... 详细信息

为了筛选和鉴定与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)非结构蛋白15 (non-structural protein 15， Nsp15)互作的关键宿主蛋白。通过IP/pull down beads结合质谱技术筛选、鉴定与PEDV非结构蛋白Nsp15互作的宿主蛋白，并利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)、激光共聚焦验证其互作关系，最后应用western blotting和RT-qPCR初步明确宿主蛋白SLC25a3与PEDV之间的作用关系。本研究成功构建了Nsp15重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-Flag-Nsp15，并筛选出与PEDV Nsp15互作的宿主蛋白SLC25a3。免疫共沉淀及激光共聚焦结果显示PEDV Nsp15与宿主蛋白SLC25a3存在互作关系。宿主蛋白SLC25a3能够显著抑制PEDV复制且呈现剂量依赖性。本研究为进一步探究SLC25a3在抗PEDV免疫应答中的作用及机制提供了参考。

关键词：猪流行性腹泻非结构蛋白蛋白互作病毒复制

猪δ冠状病毒与猪流行性腹泻病毒的受体结合区融合表达及免疫原性分析

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生物工程学报 2024年第7期40卷 2150-2161页

作者：仝力心芦延珍于瑞明张莉萍刘霞王永录杜晓华刘新生甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

为了研发出一种可同时预防猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCo V)和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)两种病毒病的有效二联亚单位疫苗,本研究将PDCo V的受体结合域(receptor binding domain,RBD)与PEDV的RBD基因进行串联,构建至真核表达载体p CDNA3.1(+)中,利用哺乳动物细胞Expi CHO^(TM)表达系统表达纯化出PDCo V-RBD-PEDV-RBD(简写为pd RBD-pe RBD)融合蛋白,以3种不同剂量(10、20和30μg)免疫小鼠,利用ELISA和流式细胞术评估该融合蛋白诱导的体液免疫反应和细胞免疫反应,利用病毒微量中和试验测定免疫小鼠血清对PDCo V或PEDV的中和效价。结果表明,3个不同剂量组在加强免疫后均诱发了高水平的Ig G抗体,不同剂量组间抗体水平没有明显差异,说明10μg的免疫剂量即可达到较好免疫效果。流式细胞术检测结果显示,免疫组的CD3^(+)CD4^(+)T细胞比例显著升高,CD3^(+)CD8^(+)T细胞比例相对较低,这符合亚单位疫苗主导机体产生体液免疫反应的预期。同时,对血清中细胞因子白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的含量进行了检测,结果表明该融合蛋白诱导了良好的体液免疫效果,同时还产生了一定的细胞免疫应答。中和试验结果表明,10μg免疫剂量所诱导的抗体即可在体外有效中和PDCo V和PEDV两种病毒,效价分别为1:179.25和1:141.21。上述研究结果表明,pd RBD-pe RBD融合蛋白10μg免疫剂量即可诱导高水平的体液免疫反应,诱导的抗体可同时中和PDCo V和PEDV两种病毒,说明pd RBD-pe RBD融合蛋白有希望成为一种能同时预防PDCo V和PEDV的有效二联亚单位疫苗。

关键词：猪德尔塔冠状病毒猪流行性腹泻病毒受体结构域亚单位疫苗

猪流行性腹泻病毒CH/GSMQ/2022株的分离鉴定与致病性

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中国兽医学报 2024年第10期 2101-2109+2233页

作者：梁志博张中旺张莉萍于瑞明潘丽王永录曾巧英刘新生甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/甘肃省病原生物学基础学科研究中心

采集了我国甘肃省民勤县某养殖场疑似猪流行性腹泻发病猪的粪便和肠道内容物，通过RT-PCR方法对疑似阳性病料进行检测后，利用Vero细胞对其进行体外分离培养，对成功分离的病毒进行实验室鉴定，对其全基因组序列进行遗传进化分析，并通... 详细信息

采集了我国甘肃省民勤县某养殖场疑似猪流行性腹泻发病猪的粪便和肠道内容物，通过RT-PCR方法对疑似阳性病料进行检测后，利用Vero细胞对其进行体外分离培养，对成功分离的病毒进行实验室鉴定，对其全基因组序列进行遗传进化分析，并通过动物回归试验对其致病力进行评价。结果显示，该猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）阳性病料处理液接种Vero细胞盲传至第4代时可观察到典型的合胞体病变现象，第6代病毒滴度达到10-4.75TCID50/mL;电镜观察可以看到直径约为100 nm、圆形、表面有明显囊膜和纤突的PEDV样病毒粒子；全基因组测序分析表明该毒株全长28 085 bp,与经典毒株CV777代表的G1亚型毒株亲缘关系较远（同源性为96.6%）,与G2b型毒株BJ-2011-1、IA1、USA/Colorado/2013和WELL同源性较高（为98.6%）,表明该毒株属于G2b型流行毒株。动物回归试验结果显示，5日龄的仔猪在攻毒后12 h即出现呕吐、急性水样腹泻、消瘦和精神沉郁等临床症状，于24 h内症状加重而死亡，剖检后可以观察到感染仔猪的胃部肿胀，小肠高度臌气、肠壁薄而透明，内部还有未消化完的乳汁凝块。结果表明，本试验成功分离鉴定到1株PEDV G2b型流行毒株，并对其全基因组序列和致病性进行了分析，为今后针对PEDV基因功能、致病机制的研究及疫苗的开发提供了研究材料。

关键词：猪流行性腹泻病毒分离鉴定遗传进化致病性

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白Nsp8与宿主细胞互作蛋白的筛选与鉴定

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微生物学报 2024年第10期64卷 3932-3944页

作者：涂赟于瑞明张莉萍王永录潘丽刘霞杜晓华刘新生甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种能引起严重腹泻、脱水的肠道病毒,PEDV的广泛流行对生猪养殖产业造成巨大经济损失,目前仍无有效的预防和治疗手段。Nsp8是一种参与PEDV复制的重要非结构蛋白,其存在相互... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种能引起严重腹泻、脱水的肠道病毒,PEDV的广泛流行对生猪养殖产业造成巨大经济损失,目前仍无有效的预防和治疗手段。Nsp8是一种参与PEDV复制的重要非结构蛋白,其存在相互作用的宿主蛋白尚不清楚。【目的】筛选与PEDV Nsp8互作宿主蛋白,初步探究互作宿主蛋白对PEDV复制的影响,为寻找PEDV新的关键性治疗靶点提供理论基础。【方法】利用真核表达载体pcDNA3.1(+)成功构建PEDV Nsp8真核表达质粒,通过免疫共沉淀、质谱分析及激光共聚焦等技术筛选能够与其相互作用的宿主蛋白,进一步在LLC-PK细胞中通过过表达、敲低等方法探究互作宿主蛋白对PEDV复制的影响。【结果】质谱检测筛选到Nsp8潜在互作宿主蛋白36个,验证了宿主蛋白热休克蛋白成员8(heat shock protein member 8,HSPA8)与Nsp8相互作用,在LLC-PK细胞中过表达HSPA8能够剂量依赖性抑制Nsp8蛋白过表达,而且在蛋白质和转录水平显著剂量依赖性抑制PEDV复制;干扰内源性HSPA8表达能够显著促进PEDV复制,TCID50和间接免疫荧光试验检测(indirect immunofluorescent assay,IFA)结果进一步证明了HSPA8抑制PEDV复制。【结论】本研究筛选出PEDV Nsp8的互作宿主蛋白HSPA8,并且证明HSPA8能显著抑制PEDV复制,为设计以HSPA8为靶点的预防或治疗药物提供新思路。

关键词：猪流行性腹泻病毒 Nsp8 免疫共沉淀技术 HSPA8

猪德尔塔冠状病毒双脯氨酸突变S蛋白的表达及免疫原性评价

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微生物学报 2024年第8期64卷 2799-2812页

作者：文玉涵于瑞明张莉萍杜晓华潘丽王永录郭慧琛刘霞刘新生甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046

【目的】猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种重要的猪肠道冠状病毒,给全球生猪养殖业带来了巨大的经济损失,截至目前,尚无可用的商品化疫苗。本研究选择宿主免疫反应主要诱因因子棘突(spike,S)蛋白,并将PDCoV S蛋... 详细信息

【目的】猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种重要的猪肠道冠状病毒,给全球生猪养殖业带来了巨大的经济损失,截至目前,尚无可用的商品化疫苗。本研究选择宿主免疫反应主要诱因因子棘突(spike,S)蛋白,并将PDCoV S蛋白七肽重复序列1(heptapeptide repeat-1,HR1)与中心螺旋之间的环中855和856位点均突变为双脯氨酸(E855P和V856P),然后利用ExpiCHO-S真核表达系统表达、纯化重组S蛋白和双脯氨酸突变S蛋白(S2P)并评价其免疫原性及免疫保护性,以初步研制一种免疫效果较好的PDCoV亚单位疫苗。【方法】利用间接酶联免疫吸附法检测免疫小鼠血清特异性抗体IgG水平;利用血清中和试验检测免疫小鼠血清中和抗体滴度;通过流式细胞术检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖情况;通过细胞因子检测免疫小鼠干扰素(interferon,IFN)-γ、IFN-α、白细胞介素(interleukin,IL)-2和IL-4等细胞因子分泌情况;采用RT-qPCR检测攻毒后小鼠肠道组织PDCoV病毒载量;采用病理组织切片检测小鼠肠道有无病理损伤;利用免疫组织化学检测小鼠肠道组织PDCoV抗原分布情况。【结果】免疫原性结果显示,小鼠在肌肉注射S组和S2P组亚单位疫苗后能够产生较高水平的抗PDCoV特异性IgG抗体,免疫后42 d的小鼠血清均对PDCoV具有中和作用,其中,S2P组对LLC-PK细胞50%中和保护效价显著高于S组。此外,S组和S2P组显著地诱导小鼠CD_(4)^(+)T淋巴细胞增殖,并且S2P组高于S组,而S2P组能够诱导小鼠CD_(8)^(+)T淋巴细胞增殖,但S组与PBS组并无差异。同时,S组和S2P组诱导的IFN-γ、IFN-α、IL-2和IL-4等细胞因子水平均显著高于PBS组,但S组和S2P组并无差异。免疫保护性结果显示,PBS组肠组织中可检测到PDCoV病毒,肠组织出现病理损伤且可见大量PDCoV抗原,而S组和S2P组未检测到PDCoV病毒且未观察到肠组织损伤,二者之间无明显差异。【结论】S2P组较之S组能够诱导小鼠产生更高水平的抗PDCoV体液免疫应答,两组疫苗对小鼠均有一定的保护效果,本研究为后续PDCoV亚单位疫苗研发奠定坚实的基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV) S蛋白双脯氨酸突变免疫原性

2~10μm台阶高度标准物质候选物的研制和质量评价

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计量学报 2024年第3期45卷 305-310页

作者：柳迪王琛英张雅馨王云祥王松陈伦涛王永录朱楠蒋庄德西安交通大学机械工程学院陕西西安710049 西安交通大学仪器科学与技术学院陕西西安710049 西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室陕西西安710049 苏州计量测试院江苏苏州215128

微米台阶高度标准物质用于校准仪器z轴性能,传递准确的微米高度量值。利用光刻结合干法刻蚀工艺实现公称高度为2,5,10μm台阶高度标准物质候选物的制备,并对台阶高度、粗糙度和上下表面平行度进行表征。使用激光共聚焦显微镜和非球面测... 详细信息

微米台阶高度标准物质用于校准仪器z轴性能,传递准确的微米高度量值。利用光刻结合干法刻蚀工艺实现公称高度为2,5,10μm台阶高度标准物质候选物的制备,并对台阶高度、粗糙度和上下表面平行度进行表征。使用激光共聚焦显微镜和非球面测量仪进行测量,基于双边算法、直方图法、ISO算法和光学显微解耦合准则(LEL)法对台阶高度进行评定,对于同一标准物质候选物各评定方法间的标准差均不超过0.024μm,台阶高度评定值的相对偏差均在5%以内,表明不同算法的评定结果一致性水平较高且量值可靠;不同仪器的评定结果对比,说明了评定方法之间也具有良好的一致性;同时,粗糙度不超过0.04μm,上下表面平行度不超过0.03°,验证了标准物质候选物制备效果良好。

关键词：微米计量台阶高度标准物质干法刻蚀粗糙度平行度

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生物传感器及其在兽医临床检测中的应用

中国人兽共患病学报 2009年第2期25卷 183-187页

作者：张昱王永录中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

生物传感器技术是现代科技的前沿技术,是一种集现代生物技术与电子技术为一体的高科技产品,因其具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂环境中进行在线连续监测,特别是高度自动化、微型化与集成化等特点,从而获得蓬勃而... 详细信息

生物传感器技术是现代科技的前沿技术,是一种集现代生物技术与电子技术为一体的高科技产品,因其具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂环境中进行在线连续监测,特别是高度自动化、微型化与集成化等特点,从而获得蓬勃而迅速的发展,并在国民经济的各个领域如临床检测、生物医学、环境监测、食品、制药等方面得以广泛的应用.生物传感器的研究开发,已经成为世界科技发展的新热点,是21世纪新兴高科技产业的重要组成部分,具有重要的战略意义.

关键词：生物传感器临床检测兽医现代生物技术环境监测传感器技术高科技产品现代科技

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技术经济学

技术经济学

1988年

作者：王永录

来源：汇雅图书（南通市图书馆... 评论

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综采机械维修工

综采机械维修工