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山东省猪圆环病毒2型的分离鉴定及其ORF2基因遗传进化分析

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中国细胞生物学学报 2018年第6期40卷 876-883页

作者：彭涛马梓承张黎斌李宝全王方昆山东农业大学动物科技学院泰安271018 山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室泰安271018 山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心泰安271018 新希望六和股份有限公司潍坊261000

该研究对山东省某猪场疑似患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的病猪进行了临床病理学检测和病理组织切片观察。PCR检测阳性的病料处理后接种PK-15细胞,通过连续传代培养分离到一株猪圆环... 详细信息

该研究对山东省某猪场疑似患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的病猪进行了临床病理学检测和病理组织切片观察。PCR检测阳性的病料处理后接种PK-15细胞,通过连续传代培养分离到一株猪圆环2型病毒(porcine circovirus type 2,PCV2)(SDWF20107),并对其进行ORF2基因扩增、遗传进化分析以及氨基酸突变位点分析。序列分析表明,该毒株与其他参考毒株的核苷酸相似性介于77.2%~99.6%之间,氨基酸相似性介于82.1%~99.6%之间;分离株与2.1d亚型的毒株位于同一分支,表明分离毒株属于2.1d亚型。根据流行毒株的特征,该猪场改用高效圆环2型病毒疫苗并调整了免疫程序,使该猪场患病猪群症状很快消失,恢复正常生产水平。该研究结果为猪场中PCV2的基因分型及其变异情况提供了参考资料,也为今后PMWS的流行病学研究和防控提供理论依据。

关键词：猪圆环病毒2型分离鉴定遗传进化分析

柔嫩艾美尔球虫与肠炎沙门菌混合感染对雏鸡盲肠菌群的影响

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中国兽医学报 2016年第12期36卷 2081-2085页

作者：王琪崔宁王方昆李红梅赵孝民山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室山东泰安271018

为探讨柔嫩艾美尔球虫与肠炎沙门菌单独感染及混合感染对盲肠肠道菌群的影响,12日龄莱航鸡口服单独或混合感染柔嫩艾美尔球虫或肠炎沙门菌,18日龄通过16SrRNA Miseq高通量测序检测鸡盲肠菌群组成。结果表明,18日龄莱航鸡盲肠内主要菌群... 详细信息

为探讨柔嫩艾美尔球虫与肠炎沙门菌单独感染及混合感染对盲肠肠道菌群的影响,12日龄莱航鸡口服单独或混合感染柔嫩艾美尔球虫或肠炎沙门菌,18日龄通过16SrRNA Miseq高通量测序检测鸡盲肠菌群组成。结果表明,18日龄莱航鸡盲肠内主要菌群为厚壁菌门和拟杆菌门。与柔嫩艾美尔球虫或肠炎沙门菌单独感染相比,混合感染导致肠杆菌科明显增加,毛螺菌科明显减少;因此,柔嫩艾美尔球虫与肠炎沙门菌混合感染对盲肠肠道菌群的影响与两者单独感染明显不同。

关键词：混合感染柔嫩艾美尔球虫肠炎沙门菌肠道菌群

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达

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中国兽医学报 2007年第5期27卷 657-660页

作者：王方昆王一成袁秀芳徐丽华山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州320021

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆... 详细信息

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。

关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅣ 克隆表达

鸡柔嫩艾美耳球虫不同抗原蛋白部分基因真核表达质粒的构建及其酵母表面展示

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鸡柔嫩艾美耳球虫不同抗原蛋白部分基因真核表达质粒的构建及其酵...

鸡源IFN-λ3的克隆表达及抗病毒活性分析

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：韩林臻李宏梅王方昆赵孝民山东农业大学动物科技学院山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室

(目的)鸡球虫生活史复杂,分为有性生殖阶段和无性生殖阶段,生活周期中蛋白表达谱有较大差异,其单一蛋白的基因工程疫苗仅具有部分保护力。因此本研究旨在构建鸡柔嫩艾美耳球虫不同抗原蛋白部分基因真核表达质粒以期为鸡球虫串联多表位... 详细信息

(目的)鸡球虫生活史复杂,分为有性生殖阶段和无性生殖阶段,生活周期中蛋白表达谱有较大差异,其单一蛋白的基因工程疫苗仅具有部分保护力。因此本研究旨在构建鸡柔嫩艾美耳球虫不同抗原蛋白部分基因真核表达质粒以期为鸡球虫串联多表位活载体疫苗的研究奠定基础。(方法)利用基因功能预测软件,对已报道的具有较好免疫原性的Et MIC 2、Et MIC 3、EtAMA 1进行抗原表位的预测,截选抗原表位集中的基因片段;以本实验室柔嫩艾美耳球虫分离株SD-01株孢子化卵囊cDNA为模板扩增这些片段,分段克隆获得串联多表位融合基因,其大小为939 bp,然后定向克隆到真核表达载体pCTCON 2,构建获得pCT-EtC2A1C3质粒。将该串联表达质粒转染到酵母细胞EBY 100中进行诱导表达。分别用三种蛋白的单因子血清,通过Western-Blot和间接免疫荧光鉴定串联蛋白表达情况。(结果)结果显示,经Western-Blot检测,可见大小约为33 KDa的阳性反应条带:间接免疫荧光可以检测到特异性绿色荧光,表明成功构建了表达质粒pCT-EtC2A1C3,并能在酵母细胞EBY 100中表达。

关键词：柔嫩艾美耳球虫 Et MIC 2 Et MIC 3 EtAMA1 EBY100 真核表达

来源： cnki会议评论

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山东畜牧兽医 2020年第10期41卷 1-3页

作者：宋彦莹王鹏戴玉刘聪刘雨王方昆山东农业大学动物医学院/山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室山东泰安271018

本研究旨在探究鸡源IFN-λ3的克隆表达及抗病毒活性。试验成功扩增ChIFN-λ3基因并将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中。然后转化表达菌BL21并IPTG诱导表达,成功表达ChIFN-λ3重组蛋白(约35KD)。通过His柱纯化以及透析复性获得可溶蛋白... 详细信息

本研究旨在探究鸡源IFN-λ3的克隆表达及抗病毒活性。试验成功扩增ChIFN-λ3基因并将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中。然后转化表达菌BL21并IPTG诱导表达,成功表达ChIFN-λ3重组蛋白(约35KD)。通过His柱纯化以及透析复性获得可溶蛋白(0.191mg/ml)。通过体外抗VSV-EGFP病毒复制实验及Image Pro Plus数据分析IOD(sum)/Area(sum),结果显示复性后的重组ChIFN-λ3可以显著减少(约48.45%)VSV-EGFP在DF-1细胞系上的复制。结果表明,复性的原核表达重组ChIFN-λ3具有良好的抗病毒活性,为体外大量制备高效廉价的重组ChIFN-λ3奠定了基础。

关键词：鸡λ3干扰素原核表达蛋白纯化抗病毒活性

柔嫩艾美耳球虫与肠炎沙门氏菌混合感染对雏鸡盲肠菌群的影响

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柔嫩艾美耳球虫与肠炎沙门氏菌混合感染对雏鸡盲肠菌群的影响

延伸因子EF-Tu在鼠伤寒沙门菌细胞表面的定位分析

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：王琪崔宁王方昆李宏梅赵孝民山东农业大学动物科技学院山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室

肠道菌群对宿主的营养和健康起到至关重要的作用,正常肠道菌群的存在可以抑制病原体的入侵。然而肠道菌群的组成和结构并不是一成不变的,它们会随着年龄、饮食、外部环境及肠道致病菌的存在而改变。对于柔嫩艾美耳球虫与肠炎沙门氏菌混... 详细信息

肠道菌群对宿主的营养和健康起到至关重要的作用,正常肠道菌群的存在可以抑制病原体的入侵。然而肠道菌群的组成和结构并不是一成不变的,它们会随着年龄、饮食、外部环境及肠道致病菌的存在而改变。对于柔嫩艾美耳球虫与肠炎沙门氏菌混合感染对肠道菌群的影响目前的研究较少。(目的)本文研究柔嫩艾美耳球虫与肠炎沙门氏菌单独感染及混合感染对盲肠肠道菌群的影响。(方法)通过16S rRNA Miseq高通量测序检测鸡盲肠菌群组成。(结果)结果表明,18日龄莱航鸡盲肠内主要菌群为厚壁菌门和拟杆菌门。与柔嫩艾美耳球虫或肠炎沙门氏菌单独感染相比,同时感染导致肠杆菌科明显增加,毛螺菌科明显减少。此外,我们发现和同时感染相比,沙门氏菌感染三天后感染球虫和球虫感染三天后感染沙门氏菌均可使拟杆菌门增加。(结论)因此,我们认为柔嫩艾美尔球虫与肠炎沙门氏菌混合感染对盲肠肠道菌群的影响与二者单独感染明显不同。

关键词：混合感染柔嫩艾美耳球虫肠炎沙门氏菌肠道菌群

来源： cnki会议评论

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中国兽医科学 2018年第11期48卷 1381-1387页

作者：明淑贞张怡聪孙娜赵宁宁赵孝民王方昆山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室山东泰安271018 山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心山东泰安271018

以抗鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体作为检测抗体,应用蛋白质印迹、间接免疫荧光试验和免疫溶菌试验等方法鉴定EF-Tu是否存在于菌体细胞表面。结果显示,鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白可以定位到细菌表面;这是首次证实胞内蛋白E... 详细信息

以抗鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体作为检测抗体,应用蛋白质印迹、间接免疫荧光试验和免疫溶菌试验等方法鉴定EF-Tu是否存在于菌体细胞表面。结果显示,鼠伤寒沙门菌EF-Tu蛋白可以定位到细菌表面;这是首次证实胞内蛋白EF-Tu可以分泌到鼠伤寒沙门菌菌体表面。这为进一步探究EF-Tu蛋白在沙门菌侵入及胞内存活过程中的调控作用及其分子机制奠定了基础。

关键词：鼠伤寒沙门菌 EF-Tu 表面鉴定

一例鸭金黄色葡萄球菌病微生物质谱方法快速诊断

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山东畜牧兽医 2020年第11期41卷 10-11,17页

作者：刘雨刘蒙达王晓文王方昆山东农业大学动物医学院山东泰安271018 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛中华人民共和国聊城海关山东聊城

某蛋鸭场病鸭趾底肿胀和溃烂,关节肿胀,充满脓液,关节面溃烂。为确定引起病鸭死亡病因,从病死鸭脚掌关节滑囊液中分离到细菌,采用细菌培养纯化、布鲁克微生物MALDI-TOF质谱仪鉴定及药物敏感性试验对病原进行研究。结果显示,病原为金黄... 详细信息

某蛋鸭场病鸭趾底肿胀和溃烂,关节肿胀,充满脓液,关节面溃烂。为确定引起病鸭死亡病因,从病死鸭脚掌关节滑囊液中分离到细菌,采用细菌培养纯化、布鲁克微生物MALDI-TOF质谱仪鉴定及药物敏感性试验对病原进行研究。结果显示,病原为金黄色葡萄球菌;对氟苯尼考表现敏感,对恩诺沙星、磷霉素、林可霉素表现耐药。本研究分离鸭源金黄色葡萄球菌具有较强的致病性和多重耐药性,为金黄色葡萄球菌感染鸭所致疾病的诊治提供参考。

关键词：鸭金黄色葡萄球菌质谱方法实验室诊断

一株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及其免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2020年第5期42卷 451-456页

作者：孔桂慧王方昆孙淑红孟照洁许明清赵情山东农业大学动物医学院山东泰安271018 山东和康源生物育种股份有限公司山东济南250101

为确定山东省某樱桃谷种鸭场29周龄产蛋鸭发病及死亡原因,本研究从采集的发病鸭脑中分离到1株病原菌,对其纯化培养后进行形态学观察,可见圆形、呈水滴状菌落;16S rRNA扩增后测序结果显示,该基因片段与GenBank中鸭疫里默氏杆菌(RA)相应... 详细信息

为确定山东省某樱桃谷种鸭场29周龄产蛋鸭发病及死亡原因,本研究从采集的发病鸭脑中分离到1株病原菌,对其纯化培养后进行形态学观察,可见圆形、呈水滴状菌落;16S rRNA扩增后测序结果显示,该基因片段与GenBank中鸭疫里默氏杆菌(RA)相应基因同源性为99%~100%;利用RA camp鉴定引物进一步对病原菌经PCR鉴定,结果显示目的条带为610 bp,与理论扩增大小一致,将其命名为RA-sd01株;血清凝集法检测该分离株血清型为血清1型。动物回归实验结果显示该分离菌株可以导致28日龄樱桃谷肉鸭发病、死亡,其最小致死量为6.9×10~5cfu/mL。药敏试验结果显示,RA-sd01株对头孢类、氟苯尼考、多西环素等较敏感。以RA-sd01株制备灭活苗,免疫7日龄樱桃谷肉鸭,免疫后21 d以培养的RA-sd01株攻毒,攻毒剂量为106cfu/只,攻毒后7 d剖检,免疫保护率可达到90%。本研究结果表明,该产蛋种鸭群发病病原是1型RA,制备的油乳剂灭活疫苗可以对商品代肉鸭提供良好的免疫保护力,免疫保护率可达到90%,本研究为RA疫苗研制和种鸭场RA净化提供了科学的参考依据。

关键词：鸭疫里默氏杆菌血清1型分离鉴定灭活疫苗免疫保护