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NDRG2基因反转录病毒载体的构建及表达

中国组织工程研究 2014年第32期18卷 5209-5213页

作者：欧剑锋任晖王存邦白海解放军兰州军区兰州总医院血液病科甘肃省兰州市730050 解放军兰州军区兰州总医院乳腺科甘肃省兰州市730050

背景:NDRG2(N-Myc Downstream Regulated Gene 2)是一个新的抑癌基因,既可以增强经典抑癌通路的抗肿瘤效应,又可以对正常细胞的癌变起到监控。有关NDRG2在骨髓瘤发生中的功能和作用至今还未见报道。目的:构建NDRG2基因反转录病毒表达载... 详细信息

背景:NDRG2(N-Myc Downstream Regulated Gene 2)是一个新的抑癌基因,既可以增强经典抑癌通路的抗肿瘤效应,又可以对正常细胞的癌变起到监控。有关NDRG2在骨髓瘤发生中的功能和作用至今还未见报道。目的:构建NDRG2基因反转录病毒表达载体,利用包装的病毒感染人骨髓瘤细胞系U266,检测NDRG2的表达情况。方法:设计与合成引物,提取U266细胞的RNA,反转录和PCR扩增,经BamHⅠ和TaqⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳,切胶回收进行连接转化,并再次酶切鉴定;并将构建的载体包装为反转录病毒,感染U266细胞,筛选出稳定表达NDRG2的U266细胞(U266-NDRG2)克隆扩大培养,利用Western blot实验检测筛选到的U266细胞中NDRG2的表达。结果与结论:成功构建了携带NDRG2基因表达的重组载体pBaba-puro-NDRG2,并包装为反转录病毒,筛选到的U266细胞(U266-NDRG2)中NDRG2蛋白表达明显高于U266-cherry细胞和U266细胞。结果可见利用反转录病毒载体基因重组技术成功构建出携带相应基因的反转录病毒,为研究NDRG2在人骨髓瘤中的作用奠定了实验基础。

关键词：多发性骨髓瘤基因转染逆转录病毒科干细胞肿瘤干细胞骨髓瘤细胞基因转染反转录病毒载体 NDRG2基因甘肃省自然科学基金

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自噬与肿瘤

肿瘤防治研究 2011年第9期38卷 1082-1085页

作者：潘耀柱王璇白海王存邦兰州军区总医院全军血液病中心兰州730050

0引言自噬（autophagy）是真核细胞适应营养或生长因子缺乏、低氧、内质网应激等有害刺激所发生的一种应激反应,在维持蛋白代谢平衡及细胞内环境稳定中具有重要意义。与泛素-蛋白酶体介导的短寿命蛋白降解不同,自噬是溶酶体介导的长寿... 详细信息

0引言自噬（autophagy）是真核细胞适应营养或生长因子缺乏、低氧、内质网应激等有害刺激所发生的一种应激反应,在维持蛋白代谢平衡及细胞内环境稳定中具有重要意义。与泛素-蛋白酶体介导的短寿命蛋白降解不同,自噬是溶酶体介导的长寿命蛋白或细胞器的降解。从酵母至哺乳细胞都存在自噬机制,在进化上高度保守。

关键词：自噬肿瘤发生肿瘤发展肿瘤治疗

异基因造血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血

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中国组织工程研究 2015年第6期19卷 908-912页

作者：葸瑞白海王存邦解放军兰州军区兰州总医院血液科甘肃省兰州市730050

背景:近年来随着造血干细胞移植技术的提高和免疫抑制剂的使用,重型再生障碍性贫血的治疗效果有了明显改善,尤其是亲缘间HLA配型全相合异基因造血干细胞移植,取得了较高的治愈率。目的:观察异基因造血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血... 详细信息

背景:近年来随着造血干细胞移植技术的提高和免疫抑制剂的使用,重型再生障碍性贫血的治疗效果有了明显改善,尤其是亲缘间HLA配型全相合异基因造血干细胞移植,取得了较高的治愈率。目的:观察异基因造血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血的疗效。方法:自2009至2011年采用异基因造血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血患者20例,HLA配型全相合12例,不全相合8例。移植预处理采用氟达拉滨+兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白+环磷酰胺。除1例为非血缘外周血干细胞移植外,其他患者干细胞来源为动员后的骨髓和外周血干细胞联合移植。HLA全相合移植物抗宿主病预防采用环孢素联合短程甲氨蝶呤,不全相合患者采用环孢素、短程甲氨蝶呤联合吗替麦考酚酸酯。结果与结论:移植后中性粒细胞恢复>0.5×109L-1平均为12.5 d,血小板恢复>20×109 L-1平均为+18 d。20例患者随访24-60个月,总生存率75%(15例),治愈率70%(14例),死亡5例;12例全相合患者中83%治愈(10例),8例不全相合患者治疗有效率62%(5例),治愈率50%(4例)。20例患者中发生急性及慢性移植物抗宿主病5例,治疗中并发败血症4例,侵袭性真菌感染3例。结果可见异基因干细胞移植是治疗重型再生障碍性贫血的有效方法之一,尤以HLA全相合效果良好,移植后恢复快,移植物抗宿主病发生率低。

关键词：贫血,再生障碍性造血干细胞移植移植物抗宿主病干细胞移植重型再生障碍性贫血异基因干细胞移植 HLA全相合 HLA不全相合

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基因标记技术研究及应用

中国现代医学杂志 2002年第9期12卷 41-43页

作者：王存邦欧英贤白海兰州军区总医院血液科兰州730050

基因标记技术的应用研究作为第一个获得政府批准的可进入临床试验的基因转移方案,目前还基本上仅应用于针对造血干细胞及其分化细胞的研究.主要研究内容包括:干细胞生物学特性研究;影响基因转移效率的因素研究;干细胞移植后复发机制的研... 详细信息

基因标记技术的应用研究作为第一个获得政府批准的可进入临床试验的基因转移方案,目前还基本上仅应用于针对造血干细胞及其分化细胞的研究.主要研究内容包括:干细胞生物学特性研究;影响基因转移效率的因素研究;干细胞移植后复发机制的研究.从长远观点看,基因标记技术研究有望对更进一步解决一些临床及生物学问题提供技术上的支持.基因标记技术开展以来,已在正常的细胞生物学和疾病病理过程研究方面取得了其它方法无可比拟的成就.现就该领域的研究成果作一综述.

关键词：基因标记逆转录病毒载体造血干细胞

序贯放化疗后自体外周血干细胞移植治疗鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤

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中国实验血液学杂志 2013年第6期21卷 1477-1481页

作者：王存邦白海葸瑞潘耀柱徐淑芬张茜陈燕周进茂兰州军区兰州总医院血液科全军血液病中心甘肃兰州730050

本研究探讨序贯放化疗后自体外周血干细胞移植治疗鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤的疗效。2000年1月至2009年12月在我院治疗的65例经病理形态学及免疫组织化学检查确诊的鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤患者,经交替应用CHOP方案、VDLP方案和MEOP方案各... 详细信息

本研究探讨序贯放化疗后自体外周血干细胞移植治疗鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤的疗效。2000年1月至2009年12月在我院治疗的65例经病理形态学及免疫组织化学检查确诊的鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤患者,经交替应用CHOP方案、VDLP方案和MEOP方案各2疗程化疗后,均应用直线加速器进行原发部位的三维适形放射治疗,随后分为临床观察组(34例)和移植组(31例);移植组患者经化疗联合重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)方法动员自体外周血干细胞,应用TBI联合VEMAC方案实施预处理后,进行自体外周血干细胞移植;随访观察时间为3-5年。结果表明:序贯放化疗的主要不良反应为骨髓抑制及轻度局部黏膜损伤,移植组全部患者均获得造血重建,移植后4-6 d中性粒细胞均降至0,中性粒细胞≥0.5×109/L的中位时间为14(11-17)d,白细胞≥4.0×108/L的中位时间为17(16-20)d,血小板≥50×108/L的中位时间为25(23-28)d,移植后16-21 d时骨髓呈恢复期骨髓象,无特殊并发症出现;放化疗结束时,观察组总有效率91.2%,移植组总有效率90.3%,两组比较无统计学意义(P>0.05);随访1年时,观察组总有效率76.5%,移植组总有效率96.8%,两组比较具有统计学意义(P<0.05);随访3年时,观察组无病存活率占全组患者的61.3%,移植组无病存活率占全组患者的87.1%,两组比较具有统计学意义(P<0.05);随访5年时,观察组无病存活患者占该组随访5年患者的43.5%,移植组无病存活患者占该组随访5年患者的81.5%,两组比较具有统计学意义(P<0.05)。结论:序贯放化疗后自体外周血干细胞移植治疗鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤可取得满意疗效。

关键词： NK T细胞淋巴瘤序贯放化疗自体外周血干细胞移植

自体外周血造血干细胞移植后过继免疫治疗B细胞性恶性淋巴瘤的临床疗效分析

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中国实验血液学杂志 2016年第6期24卷 1748-1753页

作者：王存邦潘耀柱葸瑞徐淑芬张茜陈燕周进茂吴涛白海兰州军区兰州总医院血液科全军血液病中心甘肃兰州730050

目的:探讨自体外周血造血干细胞移植(auto-PBHSCT)后过继免疫治疗B细胞性恶性淋巴瘤(ML)的临床疗效。方法:以2000年1月至2009年12月在auto-PBHSCT后给予过继免疫治疗的110例ML患者为过继免疫治疗组(简称治疗组),以1995年1月至1999年12月... 详细信息

目的:探讨自体外周血造血干细胞移植(auto-PBHSCT)后过继免疫治疗B细胞性恶性淋巴瘤(ML)的临床疗效。方法:以2000年1月至2009年12月在auto-PBHSCT后给予过继免疫治疗的110例ML患者为过继免疫治疗组(简称治疗组),以1995年1月至1999年12月在auto-PBHSCT后未予以过继免疫治疗的74例ML患者为对照组,分析比较2组间的疗效。治疗组110例ML患者中霍奇金淋巴瘤(HL)32例,非霍奇金淋巴瘤(NHL)78例。对照组74例ML患者中HL 22例,NHL 52例。所有患者序贯化疗6个疗程后进行auto-PBHSCT。造血恢复后过继免疫治疗组每月给予重组人白细胞介素2 100万U/日×10 d为1疗程的过继免疫治疗,共6个疗程。对照组未给予过继免疫治疗。随访时间以5年为限。结果:两组中各有1例患者在移植后3月、2月时因肝功衰竭和脑出血死亡,其他患者均获得造血重建。疗效比较显示,过继免疫治疗组1、3、5年的无病生存率(DFS)为97.3%、93.6%、87.3%,对照组为91.9%、73.0%、64.9%。3、5年的DFS两组间有统计学差异(P<0.01)。过继免疫治疗组Ⅰ/Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期患者1、3、5年的DFS为100%、100%、91.7%和96.5%、91.9%、86.0%,而对照组为100%、93.3%、86.7%和89.8%、67.8%、59.3%。两组间Ⅲ/Ⅳ期患者3、5年的DFS有统计学差异(P<0.01)。HL患者疗效比较显示,两组中HL患者1、3、5年的DFS分别为100%、93.8%、84.4%和100%、72.7%、59.1%,3、5年的DFS统计学差异显著(P<0.05)。两组Ⅰ/Ⅱ期HL患者1、3、5年的DFS为100%、100%、88.9%和100%、100%、80.0%,Ⅲ/Ⅳ期HL患者1、3、5年的DFS分别为100%、91.3%、82.6%和94.1%%、64.7%、52.9%,Ⅲ/Ⅳ期HL患者3、5年的DFS有统计学差异(P<0.05)。NHL患者疗效比较显示,两组中NHL患者1、3、5年的DFS分别为96.2%、93.6%、88.5%和90.4%、73.1%、65.4%,3、5的DFS有统计学差异(P<0.01)。两组Ⅰ/Ⅱ期NHL患者1、3、5年的DFS分别为100%、100%、93.3%和100%、90.0%、90.0%,Ⅲ/Ⅳ期NHL患者1、3、5年的DFS分别为95.2%、92.1%、87.3%和88.1%、69.0%、59.5%,Ⅲ/Ⅳ期NHL患者3、5年的DFS有统计学差异(P<0.05)。结论:自体外周血造血干细胞移植后过继免疫治疗B细胞性恶性淋巴瘤疗效令人满意,尤其Ⅲ、Ⅳ期患者获益明显。

关键词：淋巴瘤 B细胞性恶性淋巴瘤自体外周血造血干细胞移植过继免疫治疗

非程控降温-80℃冷冻保存外周血干细胞的活性观察

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中国现代医学杂志 2002年第11期12卷 44-46页

作者：王存邦欧英贤白海路继红兰州军区总医院血液科兰州730050

目的 :观察非程控降温 - 80℃冷冻保存外周血造血干 /祖细胞的活性 ,为临床自体外周血造血干细胞移植提供方便、有效的冻存方法。方法 :常规方法动员外周血干细胞 ,CS - 30 0 0PLUS血细胞分离机采集干细胞 ,以 10 %二甲亚砜、10 %人AB... 详细信息

目的 :观察非程控降温 - 80℃冷冻保存外周血造血干 /祖细胞的活性 ,为临床自体外周血造血干细胞移植提供方便、有效的冻存方法。方法 :常规方法动员外周血干细胞 ,CS - 30 0 0PLUS血细胞分离机采集干细胞 ,以 10 %二甲亚砜、10 %人AB型血清、RPM116 4 0培养基为冷冻保护剂 ,2ml/管冻存干细胞 ,按第 1、2、4周和第 2、3月顺序复苏细胞并测定GM -CFU集落数、台盼兰拒染率和CD34+ 细胞百分率。结果 :用该方法冷冻保存的外周血干细胞 ,在 4周内其细胞活性与采集时的细胞活性无明显差别 (P >0 .0 5 ) ,冻存至 2～ 3个月时细胞活性则明显降低 (P <0 .0 5 )。结论 :应用血清和DMSO等作为冷冻保护剂、- 80℃直接冻存的外周血干细胞 ,在 4周内复苏后其细胞活性无明显降低。

关键词：外周血干细胞非程控降温冷冻保存细胞活性

应用含标记基因K562细胞制备的小鼠白血病模型

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中国组织工程研究与临床康复 2010年第19期14卷 3550-3553页

作者：王存邦白海葸瑞钱震张茜解放军兰州军区总医院全军血液病中心甘肃省兰州市730050

背景：文献报道应用NOD/SCID及SCID小鼠可以建立移植性人白血病小鼠模型,但由于小鼠存在免疫缺陷,使得在自体干细胞移植及移植后相关过继免疫治疗方面的研究受到限制和影响。目的：探索用SPF级Balb/c小鼠和转染GFP及NeoR基因的K562细胞... 详细信息

背景：文献报道应用NOD/SCID及SCID小鼠可以建立移植性人白血病小鼠模型,但由于小鼠存在免疫缺陷,使得在自体干细胞移植及移植后相关过继免疫治疗方面的研究受到限制和影响。目的：探索用SPF级Balb/c小鼠和转染GFP及NeoR基因的K562细胞株制备白血病模型的方法。方法：实验分为5组,A、B组和C、D组分别经X射线照射2Gy和3Gy,24h后取对数生长期的K562（GFP＋/Neo＋）细胞,A、C组尾静脉注射2×106个/只;B、D组尾静脉注射5×106个/只;E组为正常对照组。观察小鼠生存时间,进行骨髓细胞及外周血白细胞分类,采用流式细胞仪测定GFP阳性细胞及PCR方法测定Neo基因。结果与结论：实验各组在接种5~7d时发病,分别于30,23,24,17d内全部死亡;生存天均显著短于正常对照组（P〈0.01）。体质量均较正常对照组显著下降（P〈0.05）。小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解。随接种细胞数量的增加和照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中白血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP＋细胞和NeoR基因在肝、脾中的存在。结果证实Balb/c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以制备获得白血病小鼠模型。

关键词：绿色荧光蛋白基因 K562细胞新霉素磷酸转移酶基因白血病小鼠模型 Balb/c小鼠

间充质干细胞对巨噬细胞活化及其功能影响的实验研究

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中华血液学杂志 2008年第8期29卷 540-543页

作者：杨义武白海王存邦林梅武令启兰州军区兰州总医院血液科 730050

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞活化的影响。方法采用贴壁筛选法分离、纯化小鼠骨髓MSC，巯基乙酸钠腹腔注射刺激后收集小鼠腹腔巨噬细胞（MPM）。实验分为四组（A组：MPM；B组：MPM＋LPS；C组：MPM＋LP... 详细信息

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞活化的影响。方法采用贴壁筛选法分离、纯化小鼠骨髓MSC，巯基乙酸钠腹腔注射刺激后收集小鼠腹腔巨噬细胞（MPM）。实验分为四组（A组：MPM；B组：MPM＋LPS；C组：MPM＋LPS＋MSC；D组：MPM＋LPS＋MSC上清），建立共培养体系。在LPS（终浓度1μg/ml）刺激巨噬细胞18h后收集细胞培养上清，检测TNF-α、TGF—β和一氧化氮（NO）等细胞因子分泌量的变化，同时在体系中加入大肠杆菌标准菌株ATCC25922，共孵育24h后瑞特染色检查巨噬细胞吞噬功能的变化。结果巨噬细胞活化后培养上清中TNF-α和NO的含量明显上升[分别为（147．4±37．1）pg／ml，（59．9±8．7）μmol／L]；而MSC存在时，TNF-α显著减少[（97．6±30．3）pg／ml，P=0．032]，NO降到（50．9±29．5）μmol／L（P〉0．05）；当有MSC上清存在时，TNF-α和NO进一步减少为（58．3±31．5）pg／ml，（-3．4±2．3）μmol／L（P〈0．01）。MSC对巨噬细胞活化后的吞噬率及吞噬指数没有影响。结论MSC可抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的活化，而对其吞噬功能没有影响。

关键词：间充质干细胞巨噬细胞活化脂多糖