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共表达外源OCT4/SOX2可激活人胚肾细胞中内源NANOG的表达

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中国生物化学与分子生物学报 2011年第9期27卷 833-840页

作者：李珍珍成德高祎王华岩西北农林科技大学动物医学院陕西省干细胞工程技术研究中心陕西杨凌712100

自2006年诱导多能干细胞(iPS)技术诞生以来,采用病毒等载体进行的诱导方法已取得了成功.但是,其致瘤性的影响限制了病毒载体的推广与应用,而采用非病毒载体诱导iPS细胞成为研究的热点.本研究通过2个启动子的独立启动,构建了带有绿色荧... 详细信息

自2006年诱导多能干细胞(iPS)技术诞生以来,采用病毒等载体进行的诱导方法已取得了成功.但是,其致瘤性的影响限制了病毒载体的推广与应用,而采用非病毒载体诱导iPS细胞成为研究的热点.本研究通过2个启动子的独立启动,构建了带有绿色荧光标记的OCT 4/SOX 2共表达诱导载体(pOct4/Sox2-EGFP).将该载体转染HEK 293FT细胞后,阳性克隆明显表达绿色荧光.并通过RT-PCR、免疫荧光等方法证明其中的转录因子OCT 4和SOX 2能在转染细胞中高效表达,同时诱导受体细胞中内源NANOG的转录表达.本研究说明,OCT 4/SOX 2共表达载体能激活NANOG基因的内源表达,暗示着非病毒不整合载体pOct4/Sox2-EGFP本身或与其它转录因子和小分子结合可用于诱导成体细胞的重编程.因此,本研究为下一步应用质粒载体诱导体细胞重编程为iPS细胞的研究奠定了工作基础.

关键词：诱导多能干细胞(iPS) NANOG基因 pOct4/Sox2-EGFP

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抑制NHE1活性对干细胞向心肌分化的影响

生物工程学报 2008年第10期24卷 1790-1795页

作者：雷蕾窦琳闫龙窦忠英王华岩西北农林科技大学动物医学院陕西省农业分子生物学重点实验室杨凌712100

Na+/H+交换蛋白1(NHE1)在心肌细胞发育过程中发挥重要的调节功能。为深入探索NHE1活性对干细胞向心肌分化过程中产生的影响,采用二甲基亚砜(DMSO)诱导P19干细胞向心肌细胞分化,同时在培养液中添加NHE1抑制剂EMD87580,对诱导后形成的类... 详细信息

Na+/H+交换蛋白1(NHE1)在心肌细胞发育过程中发挥重要的调节功能。为深入探索NHE1活性对干细胞向心肌分化过程中产生的影响,采用二甲基亚砜(DMSO)诱导P19干细胞向心肌细胞分化,同时在培养液中添加NHE1抑制剂EMD87580,对诱导后形成的类胚体进行检测。通过细胞形态观察、免疫组织化学染色及检测心肌特异表达基因等方法证明,经诱导形成的类胚体贴壁生长后,会向心肌细胞分化并出现跳动细胞团。而经过抑制剂处理的P19干细胞尽管能够形成类胚体且贴壁培养后细胞仍具有增殖活力,细胞团周边也较整齐,但未出现向心肌细胞分化的现象。这一结果表明,抑制NHE1的活性,能够影响P19干细胞向心肌细胞的分化作用。

关键词： P19干细胞心肌细胞 EMD87580 NHE1 二甲基亚砜

通过形成类胚体诱导人羊水多能干细胞向心肌细胞分化

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生物工程学报 2008年第9期24卷 1582-1587页

作者：王晗陈帅程祥窦忠英王华岩西北农林科技大学动物医学院陕西省农业分子生物学重点实验室陕西省干细胞工程技术研究中心杨凌712100

由人羊水中分离羊水多能性干细胞，通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化。取人羊水标本进行体外培养，分离得到人羊水干细胞，已连续传代培养至42代，采用免疫细胞化学、RT-PCR和流式细胞仪技术对羊水干细胞的生物学特性进行检测。取10... 详细信息

由人羊水中分离羊水多能性干细胞，通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化。取人羊水标本进行体外培养，分离得到人羊水干细胞，已连续传代培养至42代，采用免疫细胞化学、RT-PCR和流式细胞仪技术对羊水干细胞的生物学特性进行检测。取10-15代羊水干细胞，悬浮培养使其形成类胚体，进而向心肌细胞诱导分化。培养的羊水干细胞呈成纤维样，表达部分胚胎干细胞特异标志基因，悬浮培养可形成类胚体。类胚体碱性磷酸酶（AP）检测呈阳性，表达三胚层特异标志基因fgf5、ζ-globin和α-fetoprotein。羊水干细胞形成类胚体后进行诱导，得到α-actin阳性细胞，表达心肌细胞特异标志基因Tbx5、Nkx2．5、GATA4和α—MHC。试验结果表明，从人羊水标本中可分离得到具有胚胎干细胞特性的细胞，经初步检测确定为羊水干细胞，并能通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化。

关键词：人羊水干细胞类胚体心肌细胞诱导分化

层粘连蛋白基因家族在猪多能干细胞中的表达谱分析

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生物工程学报 2017年第8期33卷 1304-1314页

作者：李焕于童马洋洋王华岩西北农林科技大学动物医学院动物生物技术系陕西省干细胞工程技术研究中心陕西杨凌712100

层粘连蛋白(Laminin)是细胞外基质的重要成分,对细胞生长、分化、运动、组织修复和再生等发挥重要调节作用。Laminin包括有A1-5、B1-4和C1-3共12个编码基因,以不同的表达模式发挥功能。其中Laminin A5作为可以支持多能细胞生长的重要基... 详细信息

层粘连蛋白(Laminin)是细胞外基质的重要成分,对细胞生长、分化、运动、组织修复和再生等发挥重要调节作用。Laminin包括有A1-5、B1-4和C1-3共12个编码基因,以不同的表达模式发挥功能。其中Laminin A5作为可以支持多能细胞生长的重要基因,得到广泛研究。但是,在所有猪相关数据库中,均未能查到Laminin A5的信息。文中通过生物信息学分析,首次确认了猪Laminin A5的存在,并进行了克隆和测序验证。为揭示Laminin基因家族在猪诱导多能干细胞(i PSCs)中的表达特性,检测了Laminin在猪各组织、体细胞和i PS细胞中的不同表达模式。发现Laminin B1基因在猪多能干细胞中存在特异性可变剪接体(LAMB1-a),且该可变剪切体的表达量与猪多能干细胞的重编程程度呈正相关。为进一步揭示和利用Laminin作为细胞外基质,用于猪多能干细胞的获取和培养优化奠定了基础。

关键词：猪多能干细胞层粘连蛋白 LAMA5 表达模式分析

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猪卵巢颗粒细胞培养及其OCT4表达研究

农业生物技术学报 2016年第9期24卷 1411-1419页

作者：刘晓鹏王华岩西北农林科技大学动物医学院

颗粒细胞在卵巢发育过程中发挥着重要生物学功能。本研究为揭示卵巢发育过程中颗粒细胞的特性,对猪(Sus scrofa)颗粒细胞进行了体外培养和检测,结果显示,颗粒细胞具有一定的干细胞特性。通过对猪卵丘卵母细胞复合体的体外培养,发现卵丘... 详细信息

颗粒细胞在卵巢发育过程中发挥着重要生物学功能。本研究为揭示卵巢发育过程中颗粒细胞的特性,对猪(Sus scrofa)颗粒细胞进行了体外培养和检测,结果显示,颗粒细胞具有一定的干细胞特性。通过对猪卵丘卵母细胞复合体的体外培养,发现卵丘颗粒细胞和卵母细胞之间有互作关系。培养原代颗粒细胞时,会出现自发聚团的现象,AP染色呈弱阳性。RT-PCR检测发现,颗粒细胞内有多种多能转录因子的表达,其中,八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)的表达谱存在剪接体。蛋白免疫印迹杂交和荧光免疫染色进一步证明,颗粒细胞表达OCT4及其剪接体,并且在原代颗粒细胞中OCT4主要分布于细胞质,而在传代培养的颗粒细胞中OCT4定位于细胞核内。本研究证明颗粒细胞表达OCT4等多能因子,并与卵母细胞之间的互作方面具有一定特性,为卵巢的发育研究提供了基础资料。

关键词：颗粒细胞多能性卵丘复合体八聚体结合转录因子(OCT4) 剪接体

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双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

生物工程学报 2010年第12期26卷 1696-1703页

作者：李军华韩翠芹邓捷王华岩西北农林科技大学动物医学院陕西省干细胞工程技术研究中心陕西省农业分子生物学重点实验室杨凌712100

利用DNA同源重组方法(基因打靶)对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高效的通用型基因打靶载体,本研究以pBS246质粒为骨架,在两个LoxP序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶(neo)基因和绿色荧光蛋白(EGFP)... 详细信息

利用DNA同源重组方法(基因打靶)对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高效的通用型基因打靶载体,本研究以pBS246质粒为骨架,在两个LoxP序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶(neo)基因和绿色荧光蛋白(EGFP)基因;在两个LoxP序列外侧分别插入两组携带"8碱基"酶切位点的多克隆位点序列(MCS-1和MCS-2)和负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因,构建成通用型基因打靶载体pGT-V1,并且在C2C12细胞中验证了载体中各个元件的功能。该载体具有如下特点:1)在载体中引入绿色荧光标记,可以实时监控载体的转染效率,而转染效率的提高为高效基因打靶提供了保证;2)在两个LoxP位点间插入绿色荧光标记,可以直观监测打靶后遗留的筛选标记的去除情况,并且可以通过流式细胞仪或免疫磁珠法,将最终去除了筛选标记的阳性细胞(即丢失绿色荧光的细胞)分选出来,降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响;3)采用"8碱基"酶切位点的MCS序列,便于DNA大片段的连接和重组,极大提高了该载体的通用性。总之,该载体优化了基因打靶的技术手段,为有效开展基因打靶和转基因动物研究提供了新平台。

关键词：同源重组绿色荧光标记打靶载体 Cre-LoxP

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猪ESRRB启动子克隆及其调控活性检测

生物工程学报 2015年第4期31卷 491-500页

作者：杨藩王亚娴杜丽霞王华岩西北农林科技大学动物医学院陕西省干细胞工程技术研究中心陕西杨凌712100 西北农林科技大学创新实验学院陕西杨凌712100

Esrrb(Estrogen related receptorβ)属于雌激素受体家族,是一类在胚胎早期外胚层细胞中表达并对干细胞多能性维持起重要作用的基因。为了探索猪ESRRB的表达和转录调控机制,克隆了3.3 kb ESRRB启动子片段,构建了相应的报告载体。并将报... 详细信息

Esrrb(Estrogen related receptorβ)属于雌激素受体家族,是一类在胚胎早期外胚层细胞中表达并对干细胞多能性维持起重要作用的基因。为了探索猪ESRRB的表达和转录调控机制,克隆了3.3 kb ESRRB启动子片段,构建了相应的报告载体。并将报告载体分别转染293T人胚肾细胞、Hela人宫颈癌细胞和小鼠C2C12成肌细胞。通过TFSEARCH和JASPER方法对ESRRB启动子潜在的转录调控位点进行分析,发现该启动子上有SMAD、STAT3、MYC、KLF4等多能转录因子的结合位点。将相应的转录因子与ESRRB启动子共转染,并检测报告基因荧光素酶的活性。结果显示猪ESRRB启动子具有明显的组织特异性调控,同时SMAD对ESRRB启动子活性有较明显的调控作用。进一步对3.3 kb片段进行了一系列的缺失,发现猪ESRRB核心区域位于5′上游的-25 bp和-269 bp之间。研究结果表明猪ESRRB启动子上潜在的转录因子结合位点及启动子核心区域是参与调控ESRRB表达的重要序列。

关键词：猪雌激素相关受体启动子多能干细胞转录调控

Sall4表达调控及其启动子核心调控区的筛选

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中国农业科学 2016年第1期49卷 176-185页

作者：王亚娴杨藩王华岩西北农林科技大学动物医学院

【目的】Sall4是一种锌指结构转录因子,对建立和维持动物多能干细胞具有重要意义。为探索猪Sall4的表达和转录调控机制,克隆了猪Sall4启动子,对其进行了功能验证和核心调控区的筛选。【方法】从猪基因组中克隆获得2.1 kb Sall4启动子片... 详细信息

【目的】Sall4是一种锌指结构转录因子,对建立和维持动物多能干细胞具有重要意义。为探索猪Sall4的表达和转录调控机制,克隆了猪Sall4启动子,对其进行了功能验证和核心调控区的筛选。【方法】从猪基因组中克隆获得2.1 kb Sall4启动子片段,并构建相应的报告载体;将报告载体p E2.1转染不同种类的细胞,进行细胞特异性表达检测;采用实时荧光定量PCR方法,检测Sall4在猪不同组织和细胞中的表达变化;通过生物信息学方法,分析Sall4启动子上各种关键顺式作用元件和潜在的转录结合位点;将多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b和Smad与Sall4启动子共转染293T细胞,利用双萤光素酶报告系统检测Sall4启动子活性;采用DNA片段缺失的方法,构建一系列Sall4启动子片段缺失报告载体,将缺失片段载体分别转入293T细胞中,并利用双萤光素酶报告系统检测启动子的活性。【结果】Sall4在多能干细胞、生殖细胞和癌化肿瘤细胞中:包括P19、293T、CHO和Hela等细胞中特异性高表达。另外,通过实时荧光定量PCR检测结果显示,Sall4的表达具有明显的组织特异性,其在猪i PS细胞和生殖相关组织,如睾丸和卵巢组织中表达最高,而在脑、心、肝和肌肉等组织中的表达较低,表明该基因与细胞多能性维持具有互作关系。应用JASPAR和GPMiner软件分析发现,Sall4启动子上有TATA box、GC box、CAAT box等顺式作用元件,以及Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b、Stat3和Smad等多能转录因子的预测结合位点。其中,Oct4、Sox2和TGF-beta信号通路因子对Sall4启动子活性有较显著的激活作用,与对照组比较Sall4启动子活性提高了3倍;而Klf4因子对Sall4启动子活性有一定的抑制作用。采用分段PCR的方法,对2.1 kb启动子进行了片段缺失,分别构建了p L2.1、p L1.0和p L0.5等3个报告载体,检测结果发现,在p L2.1与p L1.0之间相差1 kb左右,但是启动子的活性没有显著差异。载体p L1.0与p L0.5之间多了486 bp片段,启动子活性提高了1倍多。另外,p L0.5的启动子活性与对照组比较提高了8倍。这些结果表明,猪Sall4启动子在-367至-852 bp和-1至-366 bp两个区域内存在核心调控区。【结论】克隆了猪Sall4启动子,证明Sall4的表达具有明显的组织特异性;Sall4启动子序列上存在众多潜在的转录因子结合位点和启动子核心调控域,是参与调控Sall4表达的重要序列,这些转录因子与Sall4相互作用对Sall4在多能细胞中的表达调控发挥重要作用。

关键词：猪 Sall4 启动子多能性转录调控

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诱导多能干细胞(iPS)的诱导培养与鉴定

生物工程学报 2010年第4期26卷 421-430页

作者：成德雷蕾卢智娟李珍王华岩西北农林科技大学动物医学院陕西省农业分子生物学重点实验室陕西省干细胞工程技术研究中心杨凌712100

通过外源转录调控因子的诱导,使成体细胞重编程为胚胎干细胞(ES细胞)样的多能细胞,这种细胞称为诱导多能干细胞(iPS细胞),这一方法被称为iPS技术。目前,iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用,建立了相应的iPS细胞系,并获... 详细信息

通过外源转录调控因子的诱导,使成体细胞重编程为胚胎干细胞(ES细胞)样的多能细胞,这种细胞称为诱导多能干细胞(iPS细胞),这一方法被称为iPS技术。目前,iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用,建立了相应的iPS细胞系,并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处,但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究,对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。

关键词：诱导多能干细胞转录因子细胞重编程诱导胚胎干细胞