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柑橘大实蝇转录组测序和滞育相关基因克隆研究

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柑橘大实蝇转录组测序和滞育相关基因克隆研究

作者：王刘豪河南科技学院

学位级别：硕士

昆虫能够通过滞育避免恶劣环境对自身生长发育造成的伤害，从而保证种群的延续。根据昆虫在不同发育时期进入滞育的状态，能够将昆虫的滞育划分为卵滞育、幼虫滞育、蛹滞育和成虫滞育。柑橘大实蝇属于蛹滞育类昆虫，以蛹越冬后羽化为成... 详细信息

昆虫能够通过滞育避免恶劣环境对自身生长发育造成的伤害，从而保证种群的延续。根据昆虫在不同发育时期进入滞育的状态，能够将昆虫的滞育划分为卵滞育、幼虫滞育、蛹滞育和成虫滞育。柑橘大实蝇属于蛹滞育类昆虫，以蛹越冬后羽化为成虫产卵于幼果中，幼虫蛀果危害。影响昆虫滞育的因素很多，除了受激素作用外，胁迫基因也参与其中，如热激蛋白(Heat shock protein Hsp)基因在以滞育形式越冬的昆虫中呈现不同的表达模式，表明其可能在滞育昆虫抵抗低温环境中起着不同程度的作用。为了研究在柑橘大实蝇蛹滞育过程中起调节作用的因素，本文首先对滞育前期(3龄幼虫)、滞育维持期(60天蛹)和滞育后期(将羽化的2级蛹)的柑橘大实蝇进行转录组测序，通过生物信息学分析找出与滞育相关的基因，如滞育激素基因、促前胸腺激素基因等;其次克隆三种热激蛋白基因hsp23、hsp70及hsp90的cDNA全长序列，并对其编码蛋白质的氨基酸序列进行系统树分析及对这三种基因在不同发育时期的mRNA表达分析，以期从分子角度揭示调控柑橘大实蝇蛹滞育的机制，为打破滞育，控制滞育，进而开展辐照不育和遗传不育控制柑橘大实蝇的危害提供理论依据。本文的主要研究结果如下： 1.转录组测序后，对测序所得reads进行预处理之后，得到3个样本的CleanRead为167，509,796条，使用SOAPdenovo软件将所有的样品reads分别进行拼接，拼接后转录本长度主要集中在200bp500bp，且总数超过了20,000条。通过RPKM计算后发现不同基因在不同滞育时期具有不同的表达量，利用Bowtie对转录本进行比对，并用DESeq进行两两差异比较后发现，DP和DM间的差异表达基因为335个，DR和DP间为554个，而DM和DR间则为177个。另外，所测样本的Unigenes为24,741个，并且大多数Unigenes在其他物种中也广泛存在，尤其在双翅目昆虫中。 2.以柑橘大实蝇为材料，通过同源扩增和RACE法克隆出包含开放阅读框和3’端PolyA结构的长度分别为810bp、2269bp和1730bp的hsp23、hsp70及hsp90基因cDNA的全长序列，其中编码的氨基酸分别为170aa、637aa及363aa。将编码的氨基酸与已知物种进行Blast比对发现，柑橘大实蝇的hsp23、hsp70及hsp90基因与其它物种的同源性分别为：32%1%、72%6%及76%8%，说明hsp70和hsp90具有很强的保守性;3.选取α-TUB、18s rRNA、28s rRNA、β-actin、GAPDH、RPL32、β-TUB、ELF1-β、G6PDH和EF1-α10个内参基因，利用引物克隆其中间片段，通过半定量PCR检测这10种内参基因在柑橘大实蝇不同时期(卵、幼虫以及30、90、160日龄蛹、雌成虫、雄成虫)的表达状况，结果表明，3个内参基因α-TUB、RPL32与EF1-α在不同发育时期稳定表达，其他7个在不同发育时期表达存在显著差异;4.利用定量PCR检测这三种基因在柑橘大实蝇滞育前期(卵及幼虫)、滞育期(蛹)及滞育后期(成虫)的mRNA的表达状况，结果表明hsp23、hsp70和hsp90在整个滞育过程中均保持一定的表达量，但是hsp23基因表达量相对较高， hsp70和hsp90的相对表达量则较低，并且hsp90基因在滞育前期和滞育后期也呈现出相对较高的表达量，说明柑橘大实蝇在越冬过程中起主要作用的是hsp23，而hsp90基因可能参与了调节昆虫的生长发育;5.为建立合适的RNAi体系，分别在柑橘大实蝇幼虫体内注射质量为2μg、3μg的dsRNA，并获取注射后0d、1d、2d、3d、5d的处理幼虫，并利用定量PCR检测，发现当dsRNA的注射浓度为2μg/μL时，目的基因在虫体内被沉默的效果和时间均达到了最佳。

关键词：柑橘大实蝇昆虫滞育转录组测序 HSP 基因克隆定量PCR RNAi

我国不同地区熊蜂短膜虫的感染情况及亲缘关系

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中国农业科学 2019年第6期52卷 1110-1118页

作者：唐裕杰王刘豪李凯李继莲中国农业科学院蜜蜂研究所农业部授粉昆虫生物学重点实验室

【目的】探明熊蜂肠道寄生虫——短膜虫(Crithidia bombi)的流行规律以及不同蜂种、不同地区间寄生的熊蜂短膜虫的亲缘关系。【方法】调查内蒙古、甘肃、青海、四川4个省(自治区)的25种1 007只熊蜂的短膜虫感染情况,对不同蜂种、不同地... 详细信息

【目的】探明熊蜂肠道寄生虫——短膜虫(Crithidia bombi)的流行规律以及不同蜂种、不同地区间寄生的熊蜂短膜虫的亲缘关系。【方法】调查内蒙古、甘肃、青海、四川4个省(自治区)的25种1 007只熊蜂的短膜虫感染情况,对不同蜂种、不同地区间熊蜂短膜虫的感染率进行卡方检验(SPSS 22.0),并对熊蜂短膜虫的内转录间隔区ITS序列进行PCR扩增、克隆、测序。利用特异的ITS引物扩增待检测的熊蜂肠道总DNA,之后进行凝胶电泳检测,通过是否扩增出675 bp的熊蜂短膜虫ITS基因片段来判断待检测的蜂群是否感染了熊蜂短膜虫,再进一步测序,分析不同蜂种、不同地区寄生的熊蜂短膜虫之间的亲缘关系。【结果】在调查的所有样品中,有20种262只熊蜂被短膜虫感染,感染率为26.0%。感染率最高的两种熊蜂是白背熊蜂(Bombus festivus)和火红熊蜂(B. pyrosoma),而西伯熊蜂(B. sibiricus)的短膜虫感染率最低;青海省熊蜂的短膜虫感染率最高,而内蒙古熊蜂的短膜虫感染率最低;雄蜂的感染率极显著高于工蜂和蜂王。另外,除了甘肃省的黑尾熊蜂(***)和猛熊蜂(B. difficillimus),四川省的疏熊蜂(B. remotus)、兴熊蜂(B. impetuosus)和弗里熊蜂(B. friseanus)所感染的短膜虫与其他短膜虫亲缘关系较远之外,其余大部分的熊蜂短膜虫的亲缘关系较近。【结论】熊蜂短膜虫对我国熊蜂的感染广泛,且不同蜂种、不同地理环境和不同级型间熊蜂短膜虫的感染率均有差别。熊蜂经过长期群体进化演变,不同地区形成相对固定的优势种类,因此各地区所捕捉到的熊蜂种类不同。对我国不同地区熊蜂短膜虫感染情况的统计分析侧重于样本量≥30的种类,这些种类是各地区的优势种类,另外一些熊蜂虽未能采集足够的样本,但根据已采集的样本量分析得出的感染率较高。熊蜂短膜虫存在寄主专一性,且对熊蜂宿主的感染具有适应性。我国部分地区熊蜂感染的短膜虫的亲缘关系总体来说较强,但也受到地理位置及其寄主熊蜂蜂种的影响。

关键词：熊蜂熊蜂短膜虫内转录间隔区感染率亲缘关系

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作者：王运兵，余昊，王刘豪

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转地蜂群病原微生物及肠道共生菌的变化

中国农业科学 2017年第5期50卷 951-958页

作者：刘珊王刘豪郭军李继莲徐龙龙中国农业科学院蜜蜂研究所农业部授粉昆虫生物学重点实验室昆明理工大学生命科学与技术学院

【目的】探明转地放蜂过程中常见蜜蜂病毒和寄生虫的流行规律,及不同地区工蜂肠道中两种主要共生菌Gilliamella apicola和Snodgrassella alvi的变化情况。【方法】在转地放蜂过程中,对同一意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)蜂场的... 详细信息

【目的】探明转地放蜂过程中常见蜜蜂病毒和寄生虫的流行规律,及不同地区工蜂肠道中两种主要共生菌Gilliamella apicola和Snodgrassella alvi的变化情况。【方法】在转地放蜂过程中,对同一意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)蜂场的固定蜂群连续取样,采用RT-PCR方法检测蜂群中病毒和寄生虫的感染情况,使用SPSS 17.0软件对不同地区、不同季节样本的病毒和寄生虫感染率进行卡方检验。以蜜蜂β-actin为内参基因,对不同地区样本中的共生菌***和***进行荧光定量PCR分析,检测转地过程中工蜂肠道中这两种细菌的变化情况,并采用Kendall Rank相关系数对病原物感染率和共生菌含量进行相关性分析。【结果】转地放蜂7个地区的样本中,仅检测出以色列急性麻痹病毒(IAPV)、黑蜂王台病毒(BQCV)和蜜蜂残翅病毒(DWV)3种蜜蜂病毒。其中IAPV和BQCV在所有地区均有检出且感染率较高,不同地区之间感染率差异显著;DWV感染率相对较低,不同地区之间感染率差异极显著。西方蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)在各地区样本中均未检出,东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)在4个地区的样本中检出,且不同地区间感染率差异极显著,熊蜂微孢子虫(Nosema bombi)在各个地区均有检出,不同地区间感染率差异显著;季节性差异分析表明,IAPV在不同季节的感染率差异不显著,而BQCV、DWV、***和***在不同季节的感染率差异显著,且春夏季的感染率普遍高于秋冬季;不同转地地区的工蜂肠道内均含有共生菌***和***,且两种共生菌含量在不同地区间均差异极显著;相关性分析表明,***和IAPV之间呈显著负相关作用。【结论】转地蜂场工蜂病原微生物的检测结果表明IAPV、BQCV、DWV和微孢子虫在蜂群中普遍存在;蜜蜂病原物的感染率和肠道共生菌的含量在不同地理区域间差异显著;部分病原物与肠道共生菌间呈显著负相关关系;转地放蜂方式对蜜蜂的健康状况有一定影响。

关键词：转地放蜂意大利蜜蜂病原微生物共生菌荧光定量PCR

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酢浆草岩螨的发育起点温度和有效积温

植物保护 2013年第4期39卷 103-105页

作者：秦雪峰王国昌王刘豪王运兵河南科技学院新乡453003

在温度为18、21、24、27和30℃、光周期L∥D=16h∥8h、RH 60%～70%的条件下,研究了酢浆草岩螨[Petrobia(Tetranychina)harti(Ewing)]各螨态的发育起点温度和有效积温。结果表明,酢浆草岩螨在18～30℃范围内都能完成生长发育,卵、幼螨、... 详细信息

在温度为18、21、24、27和30℃、光周期L∥D=16h∥8h、RH 60%～70%的条件下,研究了酢浆草岩螨[Petrobia(Tetranychina)harti(Ewing)]各螨态的发育起点温度和有效积温。结果表明,酢浆草岩螨在18～30℃范围内都能完成生长发育,卵、幼螨、前若螨、后若螨、产卵前期和全世代的发育起点温度分别为9.00、10.42、15.07、10.12、13.02和13.67℃,有效积温分别为100.00、35.15、24.84、39.22、22.02和183.33日.度。

关键词：酢浆草岩螨发育起点温度有效积温红花酢浆草

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锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用

湖北农业科学 2012年第19期51卷 4177-4180页

作者：王刘豪王吉田余昊王运兵河南科技学院资源与环境学院河南新乡453000

锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)具有特异性识别并敲除DNA片段中特定基因的特点,通过对DNA片段上的特定基因进行靶向修饰产生新型细胞,是能够应用于动物转基因上的一种新技术。该技术已在一些动物的研究上取得了一定的成果,相对... 详细信息

锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN)具有特异性识别并敲除DNA片段中特定基因的特点,通过对DNA片段上的特定基因进行靶向修饰产生新型细胞,是能够应用于动物转基因上的一种新技术。该技术已在一些动物的研究上取得了一定的成果,相对于传统的转基因技术,该技术在简化操作程序、缩短操作时间及提升成功率上都有很大的提高。就常用的动物转基因方法、锌指核酸酶技术的作用原理以及在动物转基因上的应用及其前景进行了论述。

关键词：锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN) 动物转基因靶向修饰

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河南省烟粉虱天敌种类调查

湖北农业科学 2012年第22期51卷 5053-5055页

作者：王刘豪余昊王秀建王运兵河南科技学院资源与环境学院河南新乡453003 辉县市农业局河南辉县453600

对河南省烟粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]天敌种类进行调查,经鉴定有3类36种,其中捕食性天敌29种,寄生性天敌4种,致病性天敌3种。天敌与烟粉虱发生的时空状态、发生环境及种群数量变动有很大的关系,两者的追随现象也十分明显。

关键词：河南烟粉虱天敌调查

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花生田昆虫群落结构分析

北京农业 2011年第15期 52-54页

作者：尹绍忠王刘豪王运兵河南科技学院资环学院河南省延津县农业局

对花生田昆虫群落进行了系统的调查,并分别运用自然系统分类法、生态功能分类法及优势度进行归类分析,基本搞清了花生田的昆虫群落结构。结果表明:花生田昆虫群落由8个目34个种组成,主要的目为鞘翅目(Coleoptera)和直翅目(Orthoptera);... 详细信息

对花生田昆虫群落进行了系统的调查,并分别运用自然系统分类法、生态功能分类法及优势度进行归类分析,基本搞清了花生田的昆虫群落结构。结果表明:花生田昆虫群落由8个目34个种组成,主要的目为鞘翅目(Coleoptera)和直翅目(Orthoptera);棉蚜(Aphis gossypii)、大猿叶甲(Colaphellus bowringi)、棉叶蝉(Amrasca biguttula)、灰飞虱(Laodelphgax striatellus)是花生田昆虫群落的优势种,是主要的防治对象;昆虫群落结构根据生态功能可以分为3个功能团,即植食性昆虫、肉食性昆虫和卫生性昆虫,其中植食性昆虫数目最多、危害也最重,对花生的产量和品质的影响最大,所以必须采用相应的措施加以防治。

关键词：花生昆虫群落优势种

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河南小麦害虫发生特点及防治技术

农业科技通讯 2012年第11期 117-118页

作者：王刘豪王加云余昊王运兵河南科技学院资源与环境学院新乡453003 河南科技学院图书馆新乡453003

在简要介绍河南小麦主要害虫发生危害特点及简析发生原因的基础上,提出了小麦主要害虫的综合防治技术体系。该技术体系在强调农业防治的同时,从播种期、拔节—孕穗期、抽穗—灌浆期3个阶段阐述了主要害虫的药剂防治方法。

关键词：河南小麦害虫危害特点防治技术