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Siglec-1小干扰慢病毒载体的构建和干扰效率验证

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中华微生物学和免疫学杂志 2012年第8期32卷 730-733页

作者：熊怡淞李畅孙懿仲人前成都军区总医院检验科 610083 第二军医大学长征医院实验诊断科

目的构建小干扰唾液酸黏附素（sialic acid—binding immunoglobulin—like lectin1，Siglec-1）的慢病毒载体，并体外筛选出具有干扰效果的病毒载体。方法利用软件设计3条Siglec-1siRNA片段，并克隆到慢病毒pGCSIL—GFP质粒载体，再与p... 详细信息

目的构建小干扰唾液酸黏附素（sialic acid—binding immunoglobulin—like lectin1，Siglec-1）的慢病毒载体，并体外筛选出具有干扰效果的病毒载体。方法利用软件设计3条Siglec-1siRNA片段，并克隆到慢病毒pGCSIL—GFP质粒载体，再与pHelper1．0载体和pHelper2．0载体共转染293T细胞，培养48h后，收集并浓缩富含慢病毒颗粒的细胞上清液。逐孔稀释法测定慢病毒滴度并转导原代培养的骨髓巨噬细胞（BMM），流式细胞术和实时荧光定量PCR筛选具有干扰效果的病毒载体。结果成功构建3个vshRNA质粒载体和一个阴性对照质粒载体，并经测序验证序列正确。包装的慢病毒滴度介于1×10^8-1×10^9TU／ml之间，适合体外转导及体内试验。体外转导BMM筛选出Lv-1能靶向抑制Siglec-1表达。结论成功构建并筛选出具有体外干扰效果的小干扰Siglec-1慢病毒载体，为体内应用该病毒载体进行基因敲除实验奠定了基础。

关键词： Siglec-1 小干扰RNA 慢病毒

Siglec-1在巨噬细胞吞噬脂质及分泌趋化因子中的作用

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中华检验医学杂志 2010年第7期33卷 691-696页

作者：熊怡淞李畅孙懿仲人前第二军医大学长征医院实验诊断科全军医学免疫诊断中心全军临床免疫重点实验室上海200003

目的研究ox-LDL刺激对体外培养小鼠巨噬细胞株RA-W264.7和原代小鼠骨髓巨噬细胞Siglec-1表达的影响,及M-CSF促进巨噬细胞Siglec-1高表达或小干扰RNA（si-RNP,）靶向抑制Siglec-1表达特点,并观察巨噬细胞吞噬脂质和分泌趋化因子的变化,... 详细信息

目的研究ox-LDL刺激对体外培养小鼠巨噬细胞株RA-W264.7和原代小鼠骨髓巨噬细胞Siglec-1表达的影响,及M-CSF促进巨噬细胞Siglec-1高表达或小干扰RNA（si-RNP,）靶向抑制Siglec-1表达特点,并观察巨噬细胞吞噬脂质和分泌趋化因子的变化,以探讨Siglec-1在巨噬细胞参与AS中的作用.方法用铜氧化法制备ox-LDL,根据预实验结果,选取ox-LDL 100μg/ml作为刺激物,在含巨噬细胞溶液中加入不同类型si-RNA或不同浓度M-CSF后,分为6组[正常对照组（仅加巨噬细胞）、ox-LDL 100μg/ml组、ox-LDL 100 μg/ml＋Si-RNA 25092 ng/ml组、ox-LDL 100μg/ml＋si-RNA 36182 ng/ml组、ox-LDL 100 μg/ml＋M-CSF 5 ng/ml组和ox-LDL 100μg/ml＋M-CSF 10 ng/ml 组].分别用si-RNA转染巨噬细胞抑制Siglec-1表达,M-CSF刺激促进巨噬细胞Siglec-1表达,并用荧光定量PCR检测Siglec-1抑制或表达增强效果.再用ox-LDL刺激48 h收集细胞和培养上清液,ELISA测定培养上清液中MIP-1 alpha、MCP-1和IL-8的浓度（每组3复孔）,以观察巨噬细胞活化情况;油红0染色观察Siglec-1抑制或表达增强后对巨噬细胞吞噬脂质颗粒的影响（每组3复孔）.结果巨噬细胞经si-RNA转染后,用荧光显微镜观察,si-RNA能有效转染巨噬细胞,转染效率约90%;荧光定量PCR检测si-RNA的结果显示,当si-RNA 2509和si-RNA,3618在最佳转染浓度（40 pmol/L）时,对Siglec-1抑制率分别为0.54±0.11和0.52±0.16;比正常对照组（1.00±0.24）高（t值分别为5.227、4.992,P均〈0.01）.M-CSF 10.g/ml刺激48 h后Siglec-1 mRNA表达增加约4倍（4.16±1.25比1.00±0.24,t=7.448,P〈0.01）.si-RNA 3618干扰Siglec-1后,MCP-1、MIP-1alpha和NIP-23个巨噬细胞趋化因子的分泌分别为（359.28±47.80）pg/ml、（33.76±14.28）ng/ml、（7.87±1.55）ng/ml,比单纯加ox-LDL 100μg/ml组明显降低[分别为（577.89±35.95）pg/ml、（69.17±11.82）ng/ml、（12.28±1.19）ng/ml,P分别〈0.001、0.05、0.01];而加M-CSF 10 ng/ml组可明显促进巨噬细胞趋化因子分泌[分别为（672.89±43.80）pg/ml、（101.31±24.17）ng/ml、（14.81±0.54）ng/ml],比单纯加ox-LDL 100μg/ml组明显升高（P均〈0.05）.同时,单纯加ox-LDL100μg/ml组可见部分细胞吞噬ox-LDL,胞内出现红色颗粒,巨噬细胞转变为泡沫细胞,M-CSF10 ng/ml和5 ng/ml组可见大量红色脂肪颗粒充满巨噬细胞胞浆,导致大量泡沫细胞形成,而si-RNA 2509和Si-RNA3618组巨噬细胞内红色脂肪颗粒比单纯加ox-LDL 100μg/ml组少,且泡沫细胞形成少.结论 Siglec-1有可能作为潜在脂质吞噬受体,参与巨噬细胞吞噬脂质演变成泡沫细胞,并激活巨噬细胞,分泌MIP-1 alpha、MCP-1和IL-8等趋化因子,诱导更多巨噬细胞和淋巴细胞的活化,从而参与粥样斑块中的炎症反应.靶向抑制Siglec-1可降低巨噬细胞脂质吞噬和分泌趋化因子能力,也有可能成为潜在治疗或延缓AS发展的新靶点.

关键词：动脉粥样硬化氧化型低密度脂蛋白唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素-1 巨噬细胞吞噬趋化因子

动脉粥样硬化患者单个核细胞Siglec-1在促进CD4+和CD8+ T淋巴细胞增殖和分泌细胞因子中的作用

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中华检验医学杂志 2013年第5期36卷 414-419页

作者：熊怡淞李畅俞娟仲人前成都军区总医院实验医学研究与保障中心第二军医大学长征医院实验诊断科

目的探讨动脉粥样硬化（AS）患者单个核细胞（PBMC）唾液酸黏附素（Siglec-1）在刺激白细胞分化抗原（CD）4+和CD8+T淋巴细胞活化增殖中的作用。方法实验研究。用磁珠分离长征医院18例急性冠状动脉综合征（ACS）和41例稳定型心绞痛（SA... 详细信息

目的探讨动脉粥样硬化（AS）患者单个核细胞（PBMC）唾液酸黏附素（Siglec-1）在刺激白细胞分化抗原（CD）4+和CD8+T淋巴细胞活化增殖中的作用。方法实验研究。用磁珠分离长征医院18例急性冠状动脉综合征（ACS）和41例稳定型心绞痛（SA）患者及32名健康对照者CD14阳性PBMC后,用不同浓度α-干扰素（IFN-α,0、2、5、10 ng/m1）刺激Siglec-1高表达,或用小干扰RNA或抗Siglec-1单抗靶向抑制Siglec-1表达,再与1名第三方健康献血者CD4+/CD8+T淋巴细胞共培养5 d。然后,将实验分为11组:健康人CD14（1组）,健康人CD14+IFN-α5 ng/rnl（2组）,健康人CD14+IFN-α5 ng/ml+anti-Siglec-12μg/ml（3组）,ACS CD14（4组）,ACS CD14+siRNA干扰对照组（Mock,5组）,ACS CD14+siRNA 679 40 nmol/L（6组）,ACS CD14+anti-Siglec-1 2μg/ml（7组）,SACD14（8组）,SA CD14+Mock（9组）,SA CD14+siRNA 679 40 nmol/L（10组）,SA CD14+anti-Siglec-12μg/ml（11组）;每组测定10份标本。用CCK-8活细胞计数试剂盒检测共培养T淋巴细胞增殖,用ELISA检测共培养T淋巴细胞分泌白细胞介素（IL）-2、IL-10、IL-12、γ干扰素（IFN-γ）。测定各组PBMC刺激T淋巴细胞分泌细胞因子的计量数据用中位数（四分位数）表示,采用非参数秩和检验。结果靶向阻断Siglec-1后（6组）,PBMC刺激CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的增殖能力减弱,PBMC刺激CD4+T淋巴细胞分泌IL-2、IL-12、IFN-γ分别为67.00（62.50～87.30）、0.86（0～1.63）、47.82（37.60～56.67）pg/ml,且分泌能力减弱;IL-10为56.00（46.25～67.40）pg/m1,且分泌能力增强;未处理组（4组）上述细胞因子分别为213.70（187.50～275.30）、6.87（4.90～8.93）、114.90（89.50～167.40）、21.08（15.70～33.20）pg/ml,二者差异有统计学意义（U值分别为8.50、17.00、8.50、87.50,P均0.05）。结论 IFN-α可刺激Siglec-1表达增加,Siglec-1可通过促进CD4+/CD8+T淋巴细胞增殖或CD4+T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子参与AS发病过程。

关键词：动脉粥样硬化唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素1 T淋巴细胞细胞增殖细胞因子类

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唾液酸黏附素在相关疾病中的表达及意义

诊断学理论与实践 2012年第4期11卷 332-335页

作者：仲人前熊怡淞第二军医大学长征医院实验诊断科上海200003 成都军区总医院检验科成都610083

唾液酸黏附素（Siglec-1或称CD169）是Siglecs家族的成员之一,属于免疫球蛋白超家族类黏附分子,其主要表达于组织的巨噬细胞上,是巨噬细胞激活的重要标志。近年来,不断有研究表明Siglec-1可表达在激活的外周血单核细胞上,如在系统性红... 详细信息

唾液酸黏附素（Siglec-1或称CD169）是Siglecs家族的成员之一,属于免疫球蛋白超家族类黏附分子,其主要表达于组织的巨噬细胞上,是巨噬细胞激活的重要标志。近年来,不断有研究表明Siglec-1可表达在激活的外周血单核细胞上,如在系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）、冠心病、系统性硬化（SSc）、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染等疾病患者的外周血中其表达均增高．基参与了激活T淋巴细胞等过程．并可作为反映疾病严重程度和活动度的指标，并可用于病情评估和治疗监测。

关键词： Siglec-1 自身免疫性疾病炎症检测

醛脱氢酶(ALDH)蛋白家族的信息学比较分析与修饰预测

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基因组学与应用生物学 2016年第1期35卷 28-33页

作者：常凯童立冬江忠勇熊怡淞张睿熊杰中国人民解放军成都军区总医院检验科成都610083 中国人民解放军成都军区总医院放射科成都610083

以ALDH1~ALDH4为核心,利用生物信息学方法对比分析ALDH家族成员的蛋白理化性质、亚细胞定位、构建分析蛋白三维模型并绘制家族系统进化树。对不稳定蛋白进行修饰预测。结果表明：ALDH家族间的序列相似性较高但同源性相对较低,氨基酸序... 详细信息

以ALDH1~ALDH4为核心,利用生物信息学方法对比分析ALDH家族成员的蛋白理化性质、亚细胞定位、构建分析蛋白三维模型并绘制家族系统进化树。对不稳定蛋白进行修饰预测。结果表明：ALDH家族间的序列相似性较高但同源性相对较低,氨基酸序列差异较大。蛋白的GRAVY值（-0.284~0.01）和分子量（47 974.0~61 810.5）没有典型的规律性分布,但不稳定指数、脂肪系数和等电点差异显著。结构分析催化位点和结合区域有较大差异,这赋予了各家族成员不同的催化活性。最后就不稳定蛋白进行了理想的模拟突变与预测分析。分析结果可为ALDH蛋白的研究提供有价值信息,为进一步研究ALDH在人体内的疾病发生途径与作用机理提供依据。

关键词：醛脱氢酶生物信息学对比分析蛋白特征修饰预测

Siglecs家族在免疫系统中的作用研究进展

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国际检验医学杂志 2009年第8期30卷 775-777页

作者：熊怡淞仲人前第二军医大学长征医院实验诊断科全军医学免疫诊断中心全军临床免疫重点实验室上海20003

免疫系统的各种细胞表面含有丰富的糖链结构,它们能被各种糖结合蛋白所识别。唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)家族就是这样一类分子,它们特异性表达于各种免疫细胞和造血细胞表面,通过识别含有唾液酸的糖链结构而促进细胞与细... 详细信息

免疫系统的各种细胞表面含有丰富的糖链结构,它们能被各种糖结合蛋白所识别。唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)家族就是这样一类分子,它们特异性表达于各种免疫细胞和造血细胞表面,通过识别含有唾液酸的糖链结构而促进细胞与细胞间结合和相互作用,介导细胞信号转导,从而调节天然免疫与获得性免疫细胞的功能。除此之外,siglecs家族成员还有介导胞吞作用(endocytosis)和病原体识别等功能,以及作为药物进入细胞的靶点进行肿瘤靶向治疗等。现就Siglecs家族主要特性及其在免疫系统中的作用研究进展作一综述。

关键词：免疫球蛋白类凝集素类炎症胞吞作用

载脂蛋白C3促进THP-1细胞向小鼠主动脉黏附

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中华微生物学和免疫学杂志 2013年第2期33卷 99-102页

作者：徐耀忠俞娟熊怡淞褚少朋王惠民仲人前南通大学附属医院检验医学中心 226001 成都军区总医院检验科上海第二军医大学长征医院实验诊断科 200003

目的探讨载脂蛋白C3（APOC3）对THP-1细胞与小鼠主动脉黏附效应的影响。方法在无菌环境下应用外科显微技术分离C57BL／6小鼠主动脉，在体外给予APOC3刺激16h后与标记有CFSE荧光的单核细胞来源THP-1细胞黏附1h，观察黏附效应的变化，同... 详细信息

目的探讨载脂蛋白C3（APOC3）对THP-1细胞与小鼠主动脉黏附效应的影响。方法在无菌环境下应用外科显微技术分离C57BL／6小鼠主动脉，在体外给予APOC3刺激16h后与标记有CFSE荧光的单核细胞来源THP-1细胞黏附1h，观察黏附效应的变化，同时应用免疫组化方法检测血管黏附分子1（VCAM-1）和细胞间黏附分子1（ICAM-1）的表达。结果给予APOC3刺激的主动脉与对照主动脉相比，与THP-1细胞的黏附效应增加，VCAM-1和ICAM-1表达上调，且前者比后者上调显著。结论载脂蛋白c3促进THP-1细胞向小鼠主动脉黏附。

关键词：载脂蛋白C3 黏附效应主动脉

白细胞介素-17在退变腰椎间盘中的表达及意义

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中国矫形外科杂志 2011年第19期19卷 1642-1645页

作者：林秋水周许辉袁文王新伟熊怡淞沈晓龙第二军医大学附属长征医院骨科上海市200003 第二军医大学附属长征医院实验诊断科上海市200003

[目的]观察白细胞介素-17(IL-17)在退变腰椎间盘组织中的表达水平,并探讨其与椎间盘退变发生发展的关系。[方法]实时荧光相对定量PCR(RQ-PCR)方法检测42例退变椎间盘组织(26例来自腰椎间盘突出症患者,16例来自腰椎管狭窄症患者)及8例正... 详细信息

[目的]观察白细胞介素-17(IL-17)在退变腰椎间盘组织中的表达水平,并探讨其与椎间盘退变发生发展的关系。[方法]实时荧光相对定量PCR(RQ-PCR)方法检测42例退变椎间盘组织(26例来自腰椎间盘突出症患者,16例来自腰椎管狭窄症患者)及8例正常对照椎间盘组织(来自4具新鲜尸体)中IL-17和孤独受体(retinoid-related orphan receptor,RORγτ)mRNA的表达水平;免疫组织化学EnVision法检测入选标本CD4表面抗原、IL-17表达水平。[结果]退变组椎间盘组织IL-17、RORγτmRNA的相对表达量显著高于正常对照组相对表达量(P<0.05),且腰椎间盘突出组和腰椎管狭窄组IL-17、RORγτmRNA表达量差异无统计学意义(t=0.669,P=0.507,T=421,P=0.38);IL-17 mRNA和RORγτmRNA相对表达水平呈线性关系(r=0.381,P=0.013);退变组椎间盘组织IL-17、CD4细胞表面抗原阳性率显著高于正常对照组(P<0.001),且腰椎间盘突出组和腰椎管狭窄组IL-17、CD4细胞表面抗原阳性率差异无统计学意义(t=1.13,P=0.265,t=1.459,P=0.152)。[结论]IL-17mRNA和蛋白表达水平在退变椎间盘组织中显著升高,说明IL-17参与椎间盘退变的病理过程,Th17细胞介导的免疫炎症反应可能在腰椎间盘退变的发生发展中起重要作用。

关键词：椎间盘炎症细胞因子逆转录聚合酶链反应免疫组织化学

冠心病患者外周血单核细胞Siglec-1在促进CD4+和CD8+T细胞增殖和活化中的作用

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冠心病患者外周血单核细胞Siglec-1在促进CD4+和CD8+T细胞增殖和...