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动物卵泡液外泌体分离方法及主要生殖功能研究进展

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中国畜牧兽医 2023年第4期50卷 1480-1488页

作者：李志杰赵莹马鑫王萌余四九王立斌潘阳阳甘肃农业大学动物医学院兰州730070

外泌体(exosome)是一种广泛存在于各种体液环境和部分组织中的纳米级、均一性膜性囊泡,主要由蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和lncRNA等多种生物成分构成。近年来,研究学者已从不同动物的卵泡液中分离出外泌体,并证实卵泡液外泌体参与卵泡... 详细信息

外泌体(exosome)是一种广泛存在于各种体液环境和部分组织中的纳米级、均一性膜性囊泡,主要由蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和lncRNA等多种生物成分构成。近年来,研究学者已从不同动物的卵泡液中分离出外泌体,并证实卵泡液外泌体参与卵泡颗粒细胞的增殖、卵子的形成及发育、动物受精、胚胎发育、以及雄性动物生殖功能等一系列生殖过程,为进一步研究卵泡液外泌体对哺乳动物生殖功能的调控提供新思路。作者重点阐述了卵泡液外泌体分离鉴定的方法、主要成分以及调控哺乳动物生殖功能的分子机制的最新进展,为全面了解外泌体结构功能、生发凋亡和作用机制提供参考,为利用外泌体探索动物生殖理论和提高动物繁殖技术并将其应用于生产实际提供相关基础信息。

关键词：外泌体分离鉴定卵泡液

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Hsp70在小鼠体外早期胚胎发育中的表达

核农学报 2019年第9期33卷 1717-1723页

作者：仇晓飞何翃闳张同享韩小红刘敏清潘阳阳余四九徐庚全甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心

为探究热休克蛋白Hsp70在小鼠体外早期胚胎发育中的表达情况以及Hsp70在胚胎发育中的作用机理,本试验采集8~12周龄SPF小白鼠的卵巢,在体式显微镜下采集卵母细胞并培养成熟,用0. 1%透明质酸酶消化卵丘卵母细胞复合体后,放入SrCl2+CB液中... 详细信息

为探究热休克蛋白Hsp70在小鼠体外早期胚胎发育中的表达情况以及Hsp70在胚胎发育中的作用机理,本试验采集8~12周龄SPF小白鼠的卵巢,在体式显微镜下采集卵母细胞并培养成熟,用0. 1%透明质酸酶消化卵丘卵母细胞复合体后,放入SrCl2+CB液中进行5 h(37℃)的孤雌激活,然后移入G1培养液进行培养。取培养至2细胞期、4~8细胞期、9~16细胞期、桑椹期和囊胚期的小鼠胚胎提取总RNA,通过实时荧光定量PCR检测Hsp70在各个时期的表达情况,免疫荧光染色检测其在各个时期小鼠胚胎的表达定位。实时荧光定量PCR结果表明,Hsp70在小鼠体外早期胚胎的2细胞期、4~8细胞期、9~16细胞期、桑椹期、囊胚期都有表达,但在2细胞期胚胎和4~8细胞期胚胎的相对表达水平较高,在9~16细胞期胚胎、桑椹期胚胎和囊胚期胚胎的相对表达水平较低。免疫荧光染色结果显示,Hsp70定位于各个时期胚胎的细胞核和细胞质中,但9~16细胞期以后Hsp70主要定位于细胞核中。综上所述,Hsp70对小鼠体外早期胚胎的发育具有潜在的调控作用,这为进一步明确热休克蛋白Hsp70在胚胎抗热应激中的作用及机理研究提供了理论依据。

关键词： Hsp70 小鼠早期胚胎表达

藏绵羊子宫内膜炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立与评价

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生物工程学报 2020年第5期36卷 908-919页

作者：韩金辉王萌潘阳阳胡学权张兴云崔燕徐庚全王立斌余四九甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心甘肃兰州730070

本研究旨在建立一种多重PCR方法检测青海藏绵羊子宫内膜炎主要的病原菌。首先,提取5种标准菌株基因组,筛选出特异性引物;然后以标准菌株的基因组为模板,建立多重PCR方法。用无菌棉拭子涂抹藏绵羊子宫,置于LB培养液中培养并编号,48 h后... 详细信息

本研究旨在建立一种多重PCR方法检测青海藏绵羊子宫内膜炎主要的病原菌。首先,提取5种标准菌株基因组,筛选出特异性引物;然后以标准菌株的基因组为模板,建立多重PCR方法。用无菌棉拭子涂抹藏绵羊子宫,置于LB培养液中培养并编号,48 h后提取样品基因组。运用单一PCR法对600份样品基因组进行检测,记录阳性样品;再挑取单一PCR法检测的阳性样品进行多重PCR检测,再次记录阳性样品,通过计算两种检测方法的符合率验证多重PCR方法;随机挑出30份阳性样品,进行病原菌分离鉴定菌种种类。单一PCR检测的样品中,无乳链球菌感染比例占47.33%,大肠杆菌占34.83%,金黄色葡萄球菌占6.5%,未检出沙门氏菌和化脓隐秘杆菌;多重PCR检测的阳性样品中,无乳链球菌感染比例占45.50%,大肠杆菌占33.50%,金黄色葡萄球菌占6.5%;两种检测结果相比较,多重PCR检测出的符合率均高于95%;分离鉴定的病原菌与两种PCR方法检测出的菌种结果基本一致。成功建立了多重PCR方法并检测出引起青海藏绵羊子宫内膜炎的主要病原菌为无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

关键词：藏绵羊子宫内膜炎无乳链球菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌多重PCR

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牦牛卵母细胞体外成熟培养及孤雌发育研究

中国农业科技导报 2023年第10期25卷 84-90页

作者：王立斌王强龙潘阳阳赵天丁天翊崔燕余四九甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心兰州730070

牦牛体外胚胎培养作为辅助生殖策略,能够有效提高其繁殖能力。为研究牦牛卵母细胞体外培养过程中不同的处理方式对孤雌激活胚胎发育质量的影响,10月份采集5~8岁健康母牦牛卵巢,抽吸法收集卵母细胞进行体外成熟诱导,设置卵丘-卵母细胞复... 详细信息

牦牛体外胚胎培养作为辅助生殖策略,能够有效提高其繁殖能力。为研究牦牛卵母细胞体外培养过程中不同的处理方式对孤雌激活胚胎发育质量的影响,10月份采集5~8岁健康母牦牛卵巢,抽吸法收集卵母细胞进行体外成熟诱导,设置卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexs,COCs)和裸卵2个试验组;TCM199培养时间分别为24、36 h;以及体外培养12 h的COCs,消化之后再移入TCM199培养12 h分别进行孤雌激活,在体外进行孤雌胚胎培养,统计卵裂率和囊胚率。结果显示,牦牛COCs的孤雌激活胚胎发育率显著低于裸卵(P<0.05),且后期出现脱卵丘细胞现象;COCs在TCM199中培养24 h的孤雌胚胎卵裂率明显高于培养36 h的处理组(P<0.05);裸卵再培养之后卵母细胞成熟率低、进行孤雌激活的卵裂率极低,且大部分发生贴壁。以上结果表明,体外培养24 h的COCs经透明质酸酶消化为裸卵的孤雌激活效果最佳,其卵裂率最高,囊胚率最高。研究结果为揭示牦牛卵母细胞孤雌激活前的不同处理方式与孤雌激活胚胎的发育质量提供了依据,可为优化卵母细胞体外培养、提高孤雌激活效果提供参考。

关键词：牦牛卵母细胞孤雌激活胚胎发育

一种基于PXR启动子报告基因药物筛选方法的构建及其应用

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生物技术通报 2021年第9期37卷 274-284页

作者：沈雅丽潘阳阳王靖雷马睿赵改红王桂荣张倩王萌甘肃农业大学动物医学院兰州730070

构建一种基于小鼠孕烷X受体(mouse pregnane X receptor,mPXR)基因启动子双荧光素酶报告基因的药物筛选方法,并应用此方法筛选PXR的诱导剂。同源重组法设计引物,扩增mPXR基因启动子,回收片段,克隆至含有荧光素酶报告基因的pGL3-basic载... 详细信息

构建一种基于小鼠孕烷X受体(mouse pregnane X receptor,mPXR)基因启动子双荧光素酶报告基因的药物筛选方法,并应用此方法筛选PXR的诱导剂。同源重组法设计引物,扩增mPXR基因启动子,回收片段,克隆至含有荧光素酶报告基因的pGL3-basic载体,构建pGL3-basic-PXRpro重组质粒。将构建的重组质粒和内参质粒pRL-TK共转染至Hepa1-6小鼠肝癌细胞中,给予小鼠PXR的阳性诱导剂地塞米松,24 h后检测PXR转录活性的诱导效果。利用此方法从恩诺沙星、氟苯尼考及10种连翘天然产物中筛选PXR诱导剂。经单克隆菌落PCR、重组质粒双酶切及DNA测序鉴定后获得阳性克隆,瞬时转染Hepa 1-6细胞后,通过双荧光素酶报告系统检测,所克隆的片段序列具有启动子活性,该活性可被地塞米松诱导,其相对活性为0.1129(P<0.05)。经报告基因药物筛选方法得出,2种抗菌药物及9种连翘天然产物对PXR启动子起激活作用。成功构建了小鼠pGL3-basic-PXRpro报告基因的药物筛选方法,为筛选PXR诱导剂提供了工具。应用此报告基因法筛选了诱导PXR的天然产物,为PXR为靶点的疾病防治提供候选药物。

关键词：孕烷X受体启动子报告基因药物筛选

TNF-α在牦牛卵母细胞及早期体外受精胚胎中的表达

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农业生物技术学报 2019年第8期27卷 1423-1433页

作者：许涛潘阳阳何翃闳李谷月陈平温泽星崔燕余四九甘肃农业大学动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)是一种促炎性辅助性T细胞(helper T cell, Th1)因子,能参与调节哺乳动物的排卵、胚胎发育和附植等生殖过程。本研究旨在通过检测TNF-α在牦牛(Bos grunniens)卵母细胞成熟及早期体外受... 详细信息

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)是一种促炎性辅助性T细胞(helper T cell, Th1)因子,能参与调节哺乳动物的排卵、胚胎发育和附植等生殖过程。本研究旨在通过检测TNF-α在牦牛(Bos grunniens)卵母细胞成熟及早期体外受精(in vitro fertilization, IVF)胚胎发育过程中的表达,探讨TNF-α在卵母细胞成熟与体外受精胚胎发育过程中的作用。本研究收集牦牛卵丘-卵母细胞复合体(cumulusoocyte complexes, COCs),在体外进行成熟培养并受精,获得体外受精胚胎,并评估植入前各时期胚胎的发育能力。采用qRT-PCR、间接免疫荧光染色、Western blot等方法从基因和蛋白水平检测TNF-α在未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞和植入前各时期胚胎中的表达与分布。结果表明:(1) 2～4细胞胚胎、5～8细胞胚胎和桑椹胚的发育率分别为(61.59±0.31)%、(53.76±0.22)%和(26.88±0.32)%,囊胚率为(16.12±0.23)%;(2) qRT-PCR结果表明,未成熟COCs、成熟COCs、桑椹胚和囊胚均可检测到TNF-α基因的表达,其相对表达水平由高到低依次为成熟COCs、未成熟COCs、囊胚和桑椹胚,2～4细胞胚胎和5～8细胞胚胎无表达;(3) Western blot结果显示,TNF-α蛋白相对表达水平由高到低依次为成熟COCs、未成熟COCs、囊胚和桑椹胚,2～4细胞胚胎和5～8细胞胚胎无表达;免疫荧光染色结果显示,TNF-α蛋白主要分布在COCs、桑椹胚和囊胚的细胞质中,在细胞核中表达较弱。本研究表明,TNF-α可能在牦牛卵母细胞的成熟、受精和胚胎发育过程中发挥作用,也可能参与囊胚的细胞凋亡和附植过程。本研究为揭示TNF-α在牦牛生殖过程中的作用机制提供了理论依据。

关键词：肿瘤坏死因子α(TNF-α) 牦牛体外受精胚胎发育

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适用于岛屿环境的微电网发电系统设计

电力学报 2019年第4期34卷 395-398,410页

作者：王金玉潘阳阳钱勇上海太阳能科技有限公司上海201108 上海卫星装备研究所上海200240

海岛居民由于地势限制导致用电成本偏高,依靠海岛地区丰富的光照及风力资源,可以从根本上解决偏远地区用电问题。根据使用场景特点研究了海岛盐雾环境对微电网电气系统中各种设备、材料耐候性的影响,对微电网电气系统和结构系统进行了设... 详细信息

海岛居民由于地势限制导致用电成本偏高,依靠海岛地区丰富的光照及风力资源,可以从根本上解决偏远地区用电问题。根据使用场景特点研究了海岛盐雾环境对微电网电气系统中各种设备、材料耐候性的影响,对微电网电气系统和结构系统进行了设计,研究了适用于海岛环境电站的具体运行模式,并展开运行控制策略研究,最后,设计了适用于岛屿环境的微电网系统。该系统具有成本较低、节能环保、便于推广的特点,其市场前景可观,具有非常大的经济效益。

关键词：微电网光伏发电智慧能源多能互补

FSH对牦牛卵母细胞EGF、EGFR表达及其细胞凋亡的影响

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畜牧兽医学报 2018年第9期49卷 1899-1907页

作者：何翃闳潘阳阳张慧珠李秦王萌崔燕樊江峰余四九甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心兰州730070

旨在研究促卵泡素(FSH)对牦牛卵母细胞体外成熟,以及对表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)的表达影响和与细胞凋亡的关系。在牦牛卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度FSH(终浓度分别为0、2、5、10μg·mL^(-1)),体外成熟培养... 详细信息

旨在研究促卵泡素(FSH)对牦牛卵母细胞体外成熟,以及对表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)的表达影响和与细胞凋亡的关系。在牦牛卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度FSH(终浓度分别为0、2、5、10μg·mL^(-1)),体外成熟培养后,运用实时荧光定量PCR(qRT-RCR)和免疫荧光染色技术检测EGF、EGFR表达情况,采用qRT-RCR和蛋白免疫印迹法检测Bax、Bcl-2表达变化。结果表明:1)成熟培养液中加入FSH可提高COCs成熟率,当成熟液中FSH为5μg·mL^(-1)时,成熟率最高,达到76.84%,显著高于其他组(P<0.05);2)随着FSH浓度的增加,EGF和EGFR表达逐渐升高,其中在5μg·mL^(-1) FSH组中,EGF和EGFR的表达最高,显著高于其他组(P<0.05),而在10μg·mL^(-1)FSH组中,EGF和EGFR的表达水平降低;EGF主要位于卵丘细胞中,而EGFR在卵丘细胞和卵母细胞均有表达;3)随着FSH浓度的增加,Bax和Bcl-2的表达显示出明显的逆向模式,Bax的表达水平逐渐降低,Bcl-2的表达水平逐渐升高,在5μg·mL^(-1) FSH组中Bax的表达量最低,Bcl-2的表达量最高,而在10μg·mL^(-1)FSH组中,Bax的表达水平升高。综上表明,在牦牛卵母细胞体外成熟过程中,FSH提高了卵母细胞发育能力,诱导EGF和EGFR表达,而且可能通过调控Bax、Bcl-2等凋亡相关因子的表达,抑制卵母细胞凋亡。

关键词：牦牛卵母细胞促卵泡素表皮生长因子(EGF) 表皮生长因子受体(EGFR) 细胞凋亡

不同海拔下黄牛乳蛋白差异表达的蛋白组学分析

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中国兽医科学 2023年第9期53卷 1173-1182页

作者：余震潘阳阳王萌王立斌邱山桐高娜余四九甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心甘肃兰州730070

通过对黄牛乳进行乳成分分析及TMT定量蛋白质组学分析,筛选不同海拔黄牛乳成分差异表达蛋白,结合DAVID数据库分别进行乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白(MFGM)的GO和KEGG富集分析,使用STRING在线工具和Cytoscape 3.8.2软件构建不同海拔地区黄牛... 详细信息

通过对黄牛乳进行乳成分分析及TMT定量蛋白质组学分析,筛选不同海拔黄牛乳成分差异表达蛋白,结合DAVID数据库分别进行乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白(MFGM)的GO和KEGG富集分析,使用STRING在线工具和Cytoscape 3.8.2软件构建不同海拔地区黄牛乳清、MFGM蛋白的蛋白质互作网络。结果,两种海拔中,3 850 m海拔地区(后记作HA)黄牛乳营养成分高于2 700 m海拔地区(后记作LA)黄牛乳;HA黄牛乳清蛋白、MFGM蛋白浓度显著高于LA黄牛乳清蛋白与MFGM蛋白。乳清蛋白中123个差异表达蛋白上调,122个差异表达蛋白下调;MFGM蛋白中172个差异表达蛋白上调,95个差异表达蛋白下调。黄牛乳清蛋白、MFGM蛋白共同参与免疫调控过程、代谢过程、发育过程;共同涉及的分子功能包括调节酶活性、能量结合、脂质结合。补体和凝血级联、溶酶体代谢、Ig A产生的肠道免疫网络、抗原加工和呈递、B细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性是主要的免疫相关信号通路。结果表明,HA黄牛乳的蛋白浓度更高,可使犊牛血清总蛋白(STP)升高,从而可影响犊牛成年后的繁殖性能。HA黄牛乳清、MFGM蛋白可能在抑制肿瘤发生、增强宿主免疫防御的信号通路中发挥重要作用,LA黄牛乳汁在抑制炎症反应过程中发挥作用。

关键词：海拔黄牛乳清蛋白 MFGM蛋白 TMT定量蛋白质组学