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半滑舌鳎肝脏细胞系的建立与鉴定

高技术通讯 2008年第6期18卷 657-660页

作者：任国诚陈松林沙珍霞中国海洋大学海洋生命学院青岛266003 农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071

以半滑舌鳎肝脏组织为材料,探索了组织细胞分离培养条件,建立了半滑舌鳎组织细胞培养技术及半滑舌鳎肝脏细胞系(HTLC)。该细胞系的培养基是添加了抗生素、胎牛血清(FBS)、花鲈血清(SPS)、成纤维生长因子(bFGF)的 MEM。HTLC 形态呈纤维状... 详细信息

以半滑舌鳎肝脏组织为材料,探索了组织细胞分离培养条件,建立了半滑舌鳎组织细胞培养技术及半滑舌鳎肝脏细胞系(HTLC)。该细胞系的培养基是添加了抗生素、胎牛血清(FBS)、花鲈血清(SPS)、成纤维生长因子(bFGF)的 MEM。HTLC 形态呈纤维状,在培养基中生长迅速,经200多天的培养,成功传代30多代。检测了温度、FBS 浓度、bFGF对其生长的影响,结果表明,在24～30℃生长良好,但当温度低于12℃时细胞生长速度明显减慢;在一定浓度范围内,其生长速度随血清浓度的升高而增快,血清浓度过高或过低对其生长不利;在培养基中添加 bFGF 可以使细胞生长速度显著提高;其二倍体核型为2n=21t。将绿色荧光蛋白(GFP)报告基因通过脂质体介导的方法转入 HTLC 中并成功地获得了表达,转化率为20%左右。该细胞系的建立为研究鱼类病毒学、免疫学、遗传学、功能基因组学提供了很好的实验材料。

关键词：半滑舌鳎肝脏细胞系核型 GFP报告基因

表达绿色荧光蛋白基因的花鲈胚胎干细胞株的建立及其体外分化

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高技术通讯 2006年第1期16卷 61-66页

作者：叶寒青陈松林刘洋沙珍霞中国海洋大学海洋生命学院青岛266003 中国水产科学研究院黄海水产研究所、农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室青岛266071

以带有绿色荧光标记的基因（pCMV-EGFP）为报告基因，用Genejammer、Genejuice和Metafeetene三种脂质体介导花鲈胚胎干细胞（IJES1）的基因转移。实验发现，Genejammer介导的细胞转化效率最高，高达27．3％，其余分别为12．1％和5．3％... 详细信息

以带有绿色荧光标记的基因（pCMV-EGFP）为报告基因，用Genejammer、Genejuice和Metafeetene三种脂质体介导花鲈胚胎干细胞（IJES1）的基因转移。实验发现，Genejammer介导的细胞转化效率最高，高达27．3％，其余分别为12．1％和5．3％。转移绿色荧光蛋白（GFP）基因的IJES1细胞经过药物筛选和单克隆化培养，获得了表达GFP基因的阳性克隆细胞株，经PCR对GFP阳性细胞株的基因组DNA及提取的RNA扩增，获得了目的祭带，证实了GFP基因已经整合到LIES1细胞的基因组中，并获得了正常的表达。通过体外诱导，GFP阳性细胞能够分化为神经细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等，用悬滴法培养获得了GFP阳性细胞的拟胚体，证实了经过长期的药物筛选后，LJES1细胞仍然保持着发育的多能性。这一研究，为进一步利用海水鱼类胚胎干细胞进行遗传操作及基因工程的研究提供了方法上的探索。

关键词：脂质体绿色荧光蛋白胚胎干细胞转化体外分化

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鱼类细胞核移植研究进展及前景展望

中国水产科学 2003年第4期10卷 338-344页

作者：沙珍霞陈松林刘洋唐启升中国水产科学研究院黄海水产研究所中国水产科学研究院黄海水产研究所山东青岛　266071 中国海洋大学海洋生命学院山东青岛　266003

细胞核移植技术是目前生物技术领域研究的热点之一,其科学意义和应用价值重大。本文介绍了中国和世界上鱼类细胞核移植的研究成果及其最新进展;综述了鱼类细胞核移植的基本程序、方法和影响因素,包括胞质受体的准备、核供体的制备、核... 详细信息

细胞核移植技术是目前生物技术领域研究的热点之一,其科学意义和应用价值重大。本文介绍了中国和世界上鱼类细胞核移植的研究成果及其最新进展;综述了鱼类细胞核移植的基本程序、方法和影响因素,包括胞质受体的准备、核供体的制备、核移植和核质杂种的培养。并对鱼类细胞核移植的应用、现存问题及应用前景进行了讨论。

关键词：鱼类细胞核移植

半滑舌鳎miR-200a和miR-200b前体克隆及其免疫应答分析

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水生生物学报 2017年第2期41卷 314-320页

作者：沙珍霞陈学杰陈亚东颜慧青岛大学生命科学学院青岛266071 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛266071 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛266200 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

为了探究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)miR-200a和miR-200b在免疫应答中的作用,采用PCR方法克隆了半滑舌鳎miR-200家族的miR-200a和miR-200b的前体序列,长度分别为82和88 bp;用The mfold Web Server和Clustalx1.83软件对其前体序列进行了二级结构和同源性分析,miR-200a和miR-200b都具有典型的颈环结构,与其他物种具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,miR-200a和miR-200b在健康半滑舌鳎13种组织(肝脏、肠、脾脏、头肾、后肾、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉、胃、心脏和卵巢)中均有表达,miR-200a在头肾中表达量最高,在血液中表达量最低,miR-200b在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低;miR-200a和miR-200b在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染半滑舌鳎后不同时间点的4种免疫相关组织(肝脏、肠、脾脏和头肾)中的表达呈现出先上调后下降的规律,但表达达到峰值的时间点有所不同。miR-200a在肝脏和脾中的表达峰值出现在鳗弧菌感染后6h,在肠和头肾中则是鳗弧菌感染后12h,miR-200b在肠、脾和头肾中均在鳗弧菌感染后12h达到表达高峰;miR-200a和miR-200b在脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、葡聚糖(WGP)、聚肌胞苷酸(poly I:C)4种病原模拟物刺激后的半滑舌鳎肝脏细胞系中呈现出上调表达趋势,其中Poly I:C刺激半滑舌鳎肝脏细胞系后miR-200a上调表达趋势明显,6h的表达量为0h的9倍,在WGP刺激半滑舌鳎肝脏细胞后miR-200b上调表达趋势明显,2h的表达量为0的9倍。研究结果为揭示miRNA在半滑舌鳎免疫应答中的作用提供了科学依据。

关键词：半滑舌鳎 miR-200a miR-200b 前体克隆荧光实时定量PCR 免疫应答

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

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中国水产科学 2017年第6期24卷 1288-1297页

作者：杨光盛军陈亚东沙珍霞中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室上海海洋大学水产与生命学院青岛大学生命科学学院

构建了枯草芽孢杆菌CH菌株(Bacillus subtilis CH)壳聚糖酶基因的真核表达载体p PIC9K-CH2-Cns,在毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)中进行重组表达,获得了有生物学活性的重组壳聚糖酶,对重组壳聚糖酶的酶学特性及酶解产物进行了分析。结... 详细信息

构建了枯草芽孢杆菌CH菌株(Bacillus subtilis CH)壳聚糖酶基因的真核表达载体p PIC9K-CH2-Cns,在毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)中进行重组表达,获得了有生物学活性的重组壳聚糖酶,对重组壳聚糖酶的酶学特性及酶解产物进行了分析。结果显示,重组壳聚糖酶的分子量为29 k D,粗酶的比酶活达到133.60 U/mg,纯化后重组蛋白的比酶活为338.08 U/mg;该酶的最适作用温度为50℃,最适pH为4.5,酶动力学常数Vmax=24.39(μmol/mg)·min,Km=5.48 mg/m L;Fe2+、K+等对其酶活力有一定的激活作用,其中Mn能使酶活力提升2.4倍,Ag~+、Mg、Hg、EDTA、EGTA和SDS等存在时则对其酶活力有强烈抑制作用。利用重组壳聚糖酶酶解壳聚糖,酶解产物主要为聚合度2~10的壳寡糖,且分布均匀。以上结果表明,枯草芽孢杆菌CH菌株壳聚糖酶基因在毕赤酵母GS115中成功表达,获得了一种内切型的高酶活力重组壳聚糖酶,该重组酶具有反应条件温和、酶解产物均一等特点,可被应用于海洋甲壳质加工应用中。

关键词：壳聚糖酶枯草芽孢杆菌CH2菌株壳寡糖毕赤酵母酶学性质

半滑舌鳎甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1基因的克隆及表达分析

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渔业科学进展 2020年第3期41卷 49-59页

作者：王倩张雪陈亚东沙珍霞青岛大学生命科学学院青岛266071 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛266071 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛266071

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1(Mannan-binding lectin associated serine protease 1,MASP1)是补体凝集素途径中起重要作用的激活蛋白。本研究以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象,应用RACE技术和实时荧光定量qRT-PCR... 详细信息

甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1(Mannan-binding lectin associated serine protease 1,MASP1)是补体凝集素途径中起重要作用的激活蛋白。本研究以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象,应用RACE技术和实时荧光定量qRT-PCR技术对半滑舌鳎MASP1基因(Cynoglossus semilaevis MASP1,CsMASP1)进行了克隆和表达模式分析。结果显示,CsMASP1基因c DNA序列全长为2507 bp,5′非编码区长82 bp,3′非编码区长142 bp,开放阅读框长2283 bp,共编码760个氨基酸;CsMASP1基因包含13个外显子和12个内含子,与多数已知鱼类的MASP1基因结构一致;SMART分析显示,CsMASP1包含6个结构域,与哺乳动物、鸟类、其他鱼类的结构域一致;同源比对发现,CsMASP1和鱼类的相似度较高,与金目鲈(Latescalcarifer)的相似性最高,为76%。CsMASP1基因在11种健康组织(血液、脑、鳃、性腺、心脏、头肾、肠、肝、皮肤、脾和后肾)中均有表达,其中,在肝、脾和头肾中表达量较高;鳗弧菌(Vibro anguillarum)感染后,CsMASP1基因在6种免疫组织(血液、鳃、头肾、肠、肝和脾)中呈现不同的表达模式,在6种免疫组织中呈现明显的上调表达,肝的表达峰值出现在感染后24 h;脾和鳃的表达峰值出现在感染后6 h;肠、头肾和血液的表达峰值均出现在感染后12h;随着病原菌感染时间增加,基因表达量逐渐降低并恢复至正常水平。研究表明,CsMASP1基因参与了半滑舌鳎的免疫应答过程,本结果为半滑舌鳎的免疫机理研究奠定了基础。

关键词：半滑舌鳎 MASP1基因基因克隆基因表达免疫应答

2018年度海洋科学与极地科学基金项目评审与资助成果分析

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地球科学进展 2018年第12期33卷 1305-1313页

作者：冷疏影李薇李克强沙龙滨沙珍霞沙金国家自然科学基金委员会地球科学部北京100085

分析了2018年度国家自然科学基金委员会地球科学部四处(资助范围:海洋科学与极地科学;申请代码:D06)所管理的面上项目、青年科学基金项目、地区科学基金项目及重点项目等的申请和资助概况,总结了2017年度结题项目取得的主要研究进展,阐... 详细信息

分析了2018年度国家自然科学基金委员会地球科学部四处(资助范围:海洋科学与极地科学;申请代码:D06)所管理的面上项目、青年科学基金项目、地区科学基金项目及重点项目等的申请和资助概况,总结了2017年度结题项目取得的主要研究进展,阐述了新时代海洋科学与极地科学的学科特点及主要研究方向。

关键词：海洋与极地科学评审资助成果统计学科特点及研究方向

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绿色荧光蛋白基因向花鲈胚胎的转移及其表达

中国水产科学 2004年第5期11卷 385-390页

作者：刘洋沙珍霞陈松林隋少飞徐美瑜中国水产科学研究院黄海水产研究所中国水产科学研究院黄海水产研究所山东青岛266071 中国海洋大学山东青岛 2 660 0 3 山东青岛266071

通过显微注射的方法,将绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)基因注射入花鲈(Lateolabraxjaponicus)单细胞期受精卵动物极细胞质内。初步研究了显微注射后的花鲈胚胎的存活状况。在荧光显微镜下观察到了GFP的表达,多数胚胎表现为... 详细信息

通过显微注射的方法,将绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein,GFP)基因注射入花鲈(Lateolabraxjaponicus)单细胞期受精卵动物极细胞质内。初步研究了显微注射后的花鲈胚胎的存活状况。在荧光显微镜下观察到了GFP的表达,多数胚胎表现为嵌合性表达。利用PCR技术,从花鲈尾芽期胚胎DNA中扩增出了特异片段,大小为750bp,表明显微注射胚胎中整合了外源GFP基因。

关键词： GFP 花鲈显微注射转基因

三种脂质体介导的花鲈胚胎干细胞转化效率的比较

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水产学报 2006年第6期30卷 721-726页

作者：叶寒青陈松林沙珍霞中国海洋大学海洋生命科学学院中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室

通过3种脂质体(genejammer,genejuice和metafectene)介导绿色荧光蛋白基因转化花鲈胚胎干细胞,探讨不同脂质体介导的花鲈胚胎干细胞(LJES1)的转化效率,以及影响外源基因转化效率的因素,如细胞接种时间、初始接种密度、DNA和脂质体用量... 详细信息

通过3种脂质体(genejammer,genejuice和metafectene)介导绿色荧光蛋白基因转化花鲈胚胎干细胞,探讨不同脂质体介导的花鲈胚胎干细胞(LJES1)的转化效率,以及影响外源基因转化效率的因素,如细胞接种时间、初始接种密度、DNA和脂质体用量以及它们之间的比例等。实验发现,genejammer转化LJES1细胞效率最高,适合于该细胞系的转化。对于同一种脂质体,DNA与脂质体用量的比例对于绿色荧光蛋白基因转化LJES1最为重要,DNA与genejammer的比例为1∶6时,转化效率最高,为27.3%;DNA与genejuice的比例为1∶4时,转化效率最高,为12.1%;而DNA与metafectene的比例为1∶3时,转化效率达到最高,为5.3%。随着DNA、脂质体量的增加,转化效率有所提高,但达到一定的用量后,转化效率反而下降。

关键词：花鲈脂质体绿色荧光蛋白胚胎干细胞转化效率