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麝香草酚诱导黄曲霉孢子死亡机制的探究

麝香草酚诱导黄曲霉孢子死亡机制的探究

作者：沈青山河南科技学院

学位级别：硕士

黄曲霉(Aspergillus flavus)作为一种腐生丝状致病真菌,常见于发霉的粮食和豆类和坚果表面,其产生的次级代谢产物黄曲霉毒素(aflatoxins)对人类和动物的肝脏具有很强的致癌性能够导致其快速死亡。一些抗菌剂(伏立康唑)常用于治疗黄曲霉... 详细信息

黄曲霉(Aspergillus flavus)作为一种腐生丝状致病真菌,常见于发霉的粮食和豆类和坚果表面,其产生的次级代谢产物黄曲霉毒素(aflatoxins)对人类和动物的肝脏具有很强的致癌性能够导致其快速死亡。一些抗菌剂(伏立康唑)常用于治疗黄曲霉的感染。然而,最近研究表明黄曲霉对唑类药物产生耐药性从而导致临床治疗真菌感染的失败。因此,深层次地了解黄曲霉的死亡机制有助于新的杀菌药物研发。麝香草酚(Thymol),主要存在于唇形科百里香属植物中,是百里香属植物精油的主要成分。研究表明麝香草酚可以有效抑制细菌、霉菌和酵母的生长。本研究发现麝香草酚能够诱导黄曲霉孢子的裂解死亡,为了进一步探究其作用机理,本文深度研究了麝香草酚诱导黄曲霉孢子的死亡方式以及可能的作用靶标。主要研究结果如下:1.麝香草酚对黄曲霉的杀菌效应麝香草酚对黄曲霉表现出了高效的抑菌效应:当浓度大于80μg/ml几乎完全抑制黄曲霉孢子的生长。通过孢子活力分析发现麝香草酚处理导致超过99.9%的黄曲霉孢子死亡。扫描电镜结果显示麝香草酚能够导致黄曲霉孢子发生裂解。ROS和NO作为细胞内的信号分子,经常被报道与细胞的死亡相关。本研究发现高浓度的麝香草酚可以诱导黄曲霉孢子产生大量的ROS和NO,而且ROS和NO产生的抑制剂均可以显著降低麝香草酚的这种杀菌效应。ROS抑制剂还可以抑制NO产生。由此可见ROS可能通过诱导NO产生,参与麝香草酚对黄曲霉孢子的致死作用。2.麝香草酚导致黄曲霉孢子的死亡方式为细胞凋亡真核细胞的死亡方式包含多种,总的来讲包含细胞凋亡和细胞坏死。通过Hoechst33342和PI双染,我们采用流式细胞仪和荧光显微镜对麝香草酚处理后黄曲霉孢子的早期生理活动进行了观察。结果表明麝香草酚处理3h孢子就开始发生凋亡;并且随着时间延长凋亡比例显著增加,在处理6h后大部分孢子已处于凋亡状态。通过Tunnel染色发现麝香草酚处理9h后黄曲霉孢子出现了凋亡的另外一个特征:DNA断裂现象;通过JC-1荧光探针标记,我们发现麝香草酚处理导致线粒体的膜电位减弱,这说明线粒体膜可能受到了损伤。真核生物线粒体损伤会释放细胞色素c到细胞质中并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase),启动细胞凋亡通过caspase 9检测试剂盒,我们发现麝香草酚处理后黄曲霉孢子中caspase 9的活性急剧增加通过使用不可逆的Caspase广谱抑制剂氟甲基酮(Z-VAD-FMK)抑制Caspase的活性,发现caspase 9的活性受到显著抑制,而且发生细胞凋亡的孢子数量明显减少。这就进一步表明麝香草酚可能诱导黄曲霉孢子线粒体损伤最终导致了凋亡发生。3.电压门控钾离子通道参与孢子凋亡为了进一步探索麝香草酚诱导黄曲霉孢子细胞凋亡的潜在靶标,我们在人体蛋白-药物互作数据库DRAR-CPI中检索能够与麝香草酚进行分子互作的蛋白。从中发现人体中电压门控钾离子通道蛋白(PDB id:1ZSX)可以与麝香草酚诱互作,而且与黄曲霉中的KCNAB具有较高的同源性。电压门控钾离子通道蛋白经常被报道与细胞凋亡的启动有关。随后我们通过同源建模构建了KCNAB的三级结构,并通过模拟分子对接发现麝香草酚与黄曲霉的KCNAB的互作,发现其作用方式跟其与人体1ZSX中的作用方式类似。通过K+荧光探针PBFI标记,我们发现麝香草酚处理导致孢子内钾离子浓度瞬间升高;当外源添加电压门控钾离子通道抑制剂(4-氨基吡啶)时可以抑制钾离子浓度的增高,而且同时显著降低了凋亡的孢子数量。这些结果有力支持了生物信息学的预测结果:麝香草酚可以与KCNAB互作,其结果促进黄曲霉孢子细胞凋亡。4.黄曲霉KCNAB的敲除体的构建鉴于KCNAB在麝香草酚诱导黄曲霉孢子细胞凋亡中的作用,我们研究了KCNAB在黄曲霉的一些生理功能。我们使用黄曲霉CA14Δpyr G ku70作为母本菌株构建了缺失突变体ΔKCNAB。结果显示KCNAB缺失导致黄曲霉孢子萌发紊乱:在蒸馏水中萌发而在培养中萌发受阻。进一步研究发现缺失突变体对洋葱表皮和花生的侵染力显著降低。这很可能是由于KCNAB作为电压门控钾离子通道β亚基其缺失会导致通道对外界刺激过度反应。使用麝香草酚处理突变体,发现突变体的K+激发现象更加明显,而且凋亡现象更加显著。这不仅证实了我们关于通道过度反应的猜想,而且进一步支持了电压门控钾离子通道蛋白参与了麝香草酚导致黄曲霉孢子细胞凋亡。通过上述试验,我们的研究表明麝香草酚处理首先导致钾离子的爆发,进而引起了线粒体损伤、ROS的产生、Caspase的激活,最终导致孢子发生细胞凋亡。研究结果证明电压门控钾离子通道蛋白β亚基可以作为靶标,应用于抗黄曲霉感染新药开发和抗黄曲霉毒素污染控制的策略制定。

关键词：黄曲霉凋亡电压门控钾离子通道 ROS

扩张型心肌病人血清抗心肌线粒体ADP／ATP载体抗体测定

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临床检验杂志 1995年第S1期13卷 22-23页

作者：鲁由金沈青山湖北省襄樊市中心医院临床免疫室

扩张型心肌病人血清抗心肌线粒体ＡＤＰ／ＡＴＰ载体抗体测定鲁由金，沈青山（湖北省襄樊市中心医院临床免疫室，４４１０２１）扩张型心肌病的诊断目前仍主要依靠临床排除其他心脏病后综合分析而确立，无特异性方法，往往使早期病例漏... 详细信息

扩张型心肌病人血清抗心肌线粒体ＡＤＰ／ＡＴＰ载体抗体测定鲁由金，沈青山（湖北省襄樊市中心医院临床免疫室，４４１０２１）扩张型心肌病的诊断目前仍主要依靠临床排除其他心脏病后综合分析而确立，无特异性方法，往往使早期病例漏诊或误诊，近年来已证实扩张型心肌病...

关键词：抗心肌线粒体ADP/ATP载体抗体心肌病扩张型人血清分子量相对迁移率猪心肌硝酸纤维素膜患者血清发病机理

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幼龄温州蜜柑早期丰产试验

浙江柑桔 1989年第1期6卷 13-15页

作者：沈青山宋汝拱仙居县特产总站横溪区公所

近十余年来,我国的柑桔业迅速发展,但投产率低,已成为急待解决的问题。我县是柑桔新发展区,已发展柑桔3.5万亩,而未结果的占88％。如何提高幼龄桔园栽培管理的系统化水平,用综合技术措施,精耕细作,提高投产率,并争取早期丰产。

关键词：丰产试验温州蜜柑桔园综合技术措施高标准建园尾张保果树体结构发展区采果肥

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亚热带丘陵山区引种山楂的气候适应性分析

中国农业气象 1994年第6期15卷 36-37页

作者：朱寿燕沈青山俞树标陈宝福浙江省仙居县气象局浙江省仙居县林业局

在亚热带丘陵山区引种北方山楂试验基础上，调研山楂引种地山东泰安的气候资料，分析了山楂南引后的气候适应性，得出亚热带丘陵山区具有引种山楂的气候优势：生长季节长，春季回温早，升温慢，积温高，秋温适宜，秋雨明显，使山楂树体... 详细信息

在亚热带丘陵山区引种北方山楂试验基础上，调研山楂引种地山东泰安的气候资料，分析了山楂南引后的气候适应性，得出亚热带丘陵山区具有引种山楂的气候优势：生长季节长，春季回温早，升温慢，积温高，秋温适宜，秋雨明显，使山楂树体扩展快，坐果率高，果形大，丰产性能好。

关键词：山楂引种气候适应性亚热带

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桔园地面复盖稻草防冻的气象效应

浙江柑桔 1989年第3期6卷 25-28页

作者：沈青山张均良宋潘礼浙江仙居县特产总站仙居县下各林业工作站仙居县气象站

仙居县地处浙江东部,属柑桔种植次适宜区,冻害是柑桔生产发展的主要障碍,对沙滩桔园威胁尤大。冬季,当地群众在桔园地面上复盖稻草防冻,收到了较好效果。为了摸清桔园稻草复盖防冻的气象效应,特进行本试验。一、试验材料及方法试验设... 详细信息

仙居县地处浙江东部,属柑桔种植次适宜区,冻害是柑桔生产发展的主要障碍,对沙滩桔园威胁尤大。冬季,当地群众在桔园地面上复盖稻草防冻,收到了较好效果。为了摸清桔园稻草复盖防冻的气象效应,特进行本试验。一、试验材料及方法试验设在下各镇前泮村桔园,土壤属溪滩地泥砂土。供试树为6年生温州蜜柑(大叶尾张品系),材料为稻草和白色地膜。

关键词：桔园气象效应尾张温州蜜柑柑桔生产柑桔种植下各镇泥砂浙江东部日最低温度

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继发孔型房间隔缺损介入治疗的临床分析

华中科技大学学报（医学版） 2008年第6期37卷 838-838,840页

作者：马可忠严晓娟刘娟朱锐沈青山湖北省襄樊市中心医院心内科襄樊441021

近年来先天性心脏病的介入治疗发展迅速,特别是继发孔型房间隔缺损(ASD)介入封堵术已经成为行之有效的治疗方法[1]。我院自2004年8月至2008年3月共施行继发孔型ASD介入治疗35例,现总结如下。1对象与方法1.1研究对象35例患者,男性15例,女... 详细信息

近年来先天性心脏病的介入治疗发展迅速,特别是继发孔型房间隔缺损(ASD)介入封堵术已经成为行之有效的治疗方法[1]。我院自2004年8月至2008年3月共施行继发孔型ASD介入治疗35例,现总结如下。1对象与方法1.1研究对象35例患者,男性15例,女性20例,年龄14～62岁,经胸超声心动图(TTE)或(和)食道超声心动图(TEE)检查诊断为继发孔型ASD,均为单孔型,其中2例为房间隔膨出瘤合并继发孔型ASD,3例并发有不同程度的肺动脉高压(平均肺动脉压为40～65mmHg),但超声未见右心房向左心房血液分流,2例并发心房颤动。

关键词：房间隔缺损介入治疗封堵术

矫正性大动脉转位患者行冠状动脉造影和VVI起搏器植入术一例

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中华内科杂志 2011年第5期50卷 436-437页

作者：任勇李彬沈青山赵玉勤叶剑文华中科技大学同济医学院附属襄阳医院(襄阳市中心医院)心血管内科湖北襄阳441021

患者，男，49岁。因“间断活动后胸闷、胸痛、气短3年”入院。患者3年前开始于上楼或爬坡时发作胸闷、气短，伴胸前区针刺样痛，休息后可缓解，伴头晕、黑噱，但无晕厥。既往有慢性支气管炎史。入院体检：P45次／min，BP125／75mmHg（1m... 详细信息

患者，男，49岁。因“间断活动后胸闷、胸痛、气短3年”入院。患者3年前开始于上楼或爬坡时发作胸闷、气短，伴胸前区针刺样痛，休息后可缓解，伴头晕、黑噱，但无晕厥。既往有慢性支气管炎史。入院体检：P45次／min，BP125／75mmHg（1mmHg=0．133kPa），口唇无紫绀，

关键词：矫正性大动脉转位起搏器植入术冠状动脉造影患者 VVI 慢性支气管炎入院体检胸前区

开特灵等八种植物生长调节剂对中熟温州蜜柑、椪柑的?ū9в?

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浙江柑桔 1992年第2期9卷 24-26页

作者：陈宝福沈青山余阿忠浙江省仙居县林业局特产技术推广总站

笔者在1988年度对复合保花保果剂等7种调节剂进行筛选的基础上(见1988年《浙江柑桔》第四期)。1991年又以开特灵等8种植物生长调节剂对中熟温州蜜柑、椪柑的保花保果效应进行比较试验,现将试验结果报告如下:

关键词：温州蜜柑植物生长调节剂开特保花保果座果桔园喷施宝枳砧试验结果增产效应

维普期刊数据库评论

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吲哚对黄曲霉生长及产毒的抑制作用

现代食品科技 2015年第12期31卷 156-160页

作者：沈青山周威王淼焱莫海珍胡梁斌河南科技学院食品学院河南新乡453003

本文研究了吲哚对黄曲霉的生长以及产毒的抑制作用。通过96孔板微量法发现吲哚能够抑制黄曲霉的生长,其最小抑制浓度(MIC)为100μg/m L;进而采用差量法测定了吲哚对黄曲霉菌丝生长量的抑制作用,结果表明200μg/m L的吲哚处理可以完全抑... 详细信息

本文研究了吲哚对黄曲霉的生长以及产毒的抑制作用。通过96孔板微量法发现吲哚能够抑制黄曲霉的生长,其最小抑制浓度(MIC)为100μg/m L;进而采用差量法测定了吲哚对黄曲霉菌丝生长量的抑制作用,结果表明200μg/m L的吲哚处理可以完全抑制黄曲霉的菌丝生长。此外,通过高效液相色谱分析发现吲哚浓度达到50μg/m L时,尽管对菌丝生长量没有明显影响,但是可以有效地抑制黄曲霉毒素B1的产生。这些结果说明吲哚抑制毒素产生并不是通过抑制生长来实现的。为了进一步了解吲哚对毒素产生的抑制机制,本研究通过RT-PCR分析了吲哚对黄曲霉产毒相关基因表达的影响。结果显示吲哚对产毒调控基因afl R的影响与其对毒素的作用趋势相同,同时吲哚还能够下调其他一些产毒相关基因afl K和alf D的表达。我们的研究结果表明吲哚具有很高的开发价值应用于粮食和饲料中黄曲霉毒素污染的控制。

关键词：吲哚黄曲霉黄曲霉毒素抑制作用