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基于转录组测序对LASP1调控的肝癌细胞基因及相关功能的分析

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徐州医科大学学报 2020年第10期40卷 703-709页

作者：袁东晨张宁余彤李奇陶裕凯尤红娟孔凡运汤仁仙江苏省免疫与代谢重点实验室徐州医科大学病原生物学与免疫学教研室江苏徐州221004

目的检测LASP1在肝癌细胞中导致的基因表达变化,为深入研究LASP1介导肝癌发生发展的分子机制提供更多生物学依据。方法构建LASP1的真核表达质粒并转染肝癌细胞HepG2,建立过表达LASP1的肝癌细胞及相关的对照细胞。利用转录组测序技术检测... 详细信息

目的检测LASP1在肝癌细胞中导致的基因表达变化,为深入研究LASP1介导肝癌发生发展的分子机制提供更多生物学依据。方法构建LASP1的真核表达质粒并转染肝癌细胞HepG2,建立过表达LASP1的肝癌细胞及相关的对照细胞。利用转录组测序技术检测2组细胞的基因表达谱。通过生物信息学方法比较2组细胞间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。通过GO、KEGG pathway和WikiPathway富集分析,探讨LASP1调控的DEGs参与的生物学过程及相关通路。通过STRING数据库构建DEGs编码蛋白的相互作用网络,寻找LASP1调控的潜在关键基因。结果与对照细胞相比,在过表达LASP1的肝癌细胞中筛选出410种DEGs。其中308种DEGs表达上调,102种DEGs表达下调。GO富集分析结果显示,DEGs与离子跨膜转运、阳离子转运等生物学过程有关。DEGs的KEGG pathway富集结果主要与化学致癌等有关,WikiPathway富集的结果与组蛋白修饰等有关。DEGs编码蛋白之间能够形成复杂的蛋白相互作用网络,并且HIST1H1B、HIST1H4B、NCAM1、SLC17A7等基因为LASP1调控的潜在关键基因。结论本研究揭示了LASP1在肝癌细胞中调控的基因及其参与的离子跨膜转运和化学致癌等生物学过程和通路,为深入探讨LASP1在肝癌细胞中的生物学功能及相关的分子机制提供了基础。

关键词： LASP1 转录组测序肝癌差异表达基因生物信息学分析

甘西鼠尾草总酚酸提取物对嘌呤霉素氨基核苷诱导损伤的足细胞中Toll样受体4表达的影响

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中国中西医结合肾病杂志 2017年第8期18卷 672-675,I0002页

作者：柳云任红旗王增慧杨阳戴德淑刘翔胡雪晴李向阳刘瀛汤仁仙蚌埠医学院附属中国人民解放军第九七医院肾内科徐州221002 徐州医科大学附属淮海医院肾内科徐州221002 中国人民解放军第九七医院药剂科徐州221002 徐州医科大学感染与免疫实验室徐州221000

目的:探讨SPE及其单体对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的损伤足细胞中Toll样受体4(TLR4)通路表达的影响。方法:足细胞与含有甘西鼠尾草总酚酸提取物(SPE)、迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(SalB)、RA+SalB混合及他克莫司的完全培养液预先孵育30 min... 详细信息

目的:探讨SPE及其单体对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的损伤足细胞中Toll样受体4(TLR4)通路表达的影响。方法:足细胞与含有甘西鼠尾草总酚酸提取物(SPE)、迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(SalB)、RA+SalB混合及他克莫司的完全培养液预先孵育30 min,再加入PAN(100μg/ml)继续作用24 h,观察足细胞骨架结构F-actin变化,western blot及半定量RT-PCR检测足细胞中TLR4、myd88、phosphor-NF-κB(pp65)在蛋白及mRNA水平的表达量变化。结果:(1)PAN作用24 h后,足细胞骨架蛋白F-actin明显损伤,微丝解聚、胞体回缩,少数细胞尚存排列紊乱的丝状结构,而提前给予保护药物SPE、SalB、RA、SalB+RA混合药物及他克莫司组的足细胞损伤明显减弱。(2)western blot数据显示,PAN诱导的损伤足细胞中TLR4、myd88及pp65蛋白的表达与正常组相比均有明显上调(P0.05);My D88 mRNA表达量在SPE及其单体处理后均有明显下调(P0.05),其余各保护药物组均下调(P<0.05)。结论:SPE及其活性单体对PAN诱导损伤足细胞的保护作用机制可能部分通过抑制TLR4信号相关蛋白表达来实现;甘西鼠尾草总酚酸提取物中的单体迷迭香酸对TLR4及其下游信号分子My D88、NF-κB的抑制作用优于丹酚酸B和混合给药组。

关键词：足细胞嘌呤霉素氨基核苷甘西鼠尾草总酚酸提取物迷迭香酸丹酚酸B TLR4

特异性的shRNA抑制c－Jun蛋白表达对HepG2细胞增殖和迁移的影响

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徐州医学院学报 2015年第10期35卷 648-653页

作者：罗文雅周凯胡磊李向阳孔凡运尤红娟汤仁仙徐州医学院病原生物学与免疫学教研室感染与免疫实验室江苏徐州221004

目的：构建c－Jun特异性的shRNA及研究其抑制c－Jun蛋白表达对人类肝癌细胞HepG2增殖和迁移的影响。方法根据c－Jun编码序列设计并构建shRNA质粒，利用LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞，荧光显微镜观察转染效率。 Western blot检测其... 详细信息

目的：构建c－Jun特异性的shRNA及研究其抑制c－Jun蛋白表达对人类肝癌细胞HepG2增殖和迁移的影响。方法根据c－Jun编码序列设计并构建shRNA质粒，利用LipofectamineTM 2000转染HepG2细胞，荧光显微镜观察转染效率。 Western blot检测其对c－Jun蛋白表达的影响。 CCK－8增殖实验、平板克隆形成实验观察HepG2细胞的增殖情况，transwell和划痕愈合实验方法观察细胞的迁移情况。结果构建了c－Jun小干扰质粒shRNA－1和shRNA－2。荧光显微镜观察到shRNA质粒在HepG2细胞转染效率约在80％。 Western blot显示shRNA－2小干扰质粒对c－Jun抑制效果要强于shRNA－1小干扰质粒。功能实验结果显示，与阴性对照组相比，shRNA－2能显著抑制HepG2细胞的增殖、克隆形成及其迁移能力（P均＜0．05）。结论成功构建了对c－Jun有效shRNA干扰质粒，下调c－Jun的表达能够明显抑制肝癌细胞的增殖和迁移，为进一步研究c－Jun在肝癌中的作用及相关机制提供了工作基础。

关键词： RNA小干扰 HepG2细胞增殖迁移

流体动力学法表达乙肝病毒X蛋白小鼠模型的建立

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中国比较医学杂志 2009年第1期19卷 8-10,F0002页

作者：胡安康范宝峰朱孝荣汤仁仙郑葵阳刘晓梅徐州医学院实验动物中心徐州221002 徐州医学院病原生物学教研室徐州221002

目的建立表达乙肝病毒X蛋白的小鼠模型。方法实验动物分成模型组和对照组,模型组利用已构建的含有HBX基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HBX,对照组以等量生理盐水代替,采用流体动力学法将质粒经尾静脉高压注入小鼠体内,24h后取小鼠肝组织... 详细信息

目的建立表达乙肝病毒X蛋白的小鼠模型。方法实验动物分成模型组和对照组,模型组利用已构建的含有HBX基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HBX,对照组以等量生理盐水代替,采用流体动力学法将质粒经尾静脉高压注入小鼠体内,24h后取小鼠肝组织,行免疫荧光、RT-PCR和Western blot法从不同水平检测HBX在小鼠肝组织内的表达情况。结果模型组小鼠RT-PCR显示肝组织内有HBX mRNA的存在,免疫荧光和Western blot检测均有HBX蛋白的表达;对照组小鼠则无HBX表达。结论成功建立了表达乙肝病毒X蛋白小鼠模型,为进一步探讨HBX蛋白在动物体内的生物学作用提供实验基础。

关键词：流体动力学法真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HBX 小鼠肝组织

Podocalyxin基因沉默对足细胞结构和功能的影响

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肾脏病与透析肾移植杂志 2018年第6期27卷 538-543页

作者：胡雪晴林芙君吴伟斌王瑞许娜王福奔张兆永王增慧张琦李向阳华卉汤仁仙任红旗蚌埠医学院附属中国人民解放军第九七医院肾内科徐州221002 上海交通大学医学院附属新华医院肾内科中国人民解放军陆军第71集团军医院肾内科徐州医科大学免疫与代谢重点实验室

目的:探讨siRNA敲低podocalyxin(PODXL、足糖萼)基因对足细胞结构、功能的影响及机制。方法:采用RPMI 1640培养基,在33℃培养永生化小鼠足细胞系,分化成熟后分为5组:空白组(Vehicle)、模拟组(Mock)、阴性对照组(Sh-nc)、siRNA-PODXL组(... 详细信息

目的:探讨siRNA敲低podocalyxin(PODXL、足糖萼)基因对足细胞结构、功能的影响及机制。方法:采用RPMI 1640培养基,在33℃培养永生化小鼠足细胞系,分化成熟后分为5组:空白组(Vehicle)、模拟组(Mock)、阴性对照组(Sh-nc)、siRNA-PODXL组(Si)、ezrin抑制组(NSC305787)。用鬼笔环肽行足细胞骨架蛋白Factin染色,共聚焦荧光倒置显微镜下观察细胞骨架排列;划痕愈合实验、Transwell实验检测细胞的迁移能力;流式细胞仪检测足细胞凋亡; Western印迹法和RT-qPCR检测PODXL和p-ezrin表达水平。结果:(1)共聚焦荧光倒置显微镜下观察结果显示:空白组足细胞骨架肌纤维排列有序,荧光显示清晰; Si组、ezrin抑制组足细胞微丝解聚、胞体回缩,骨架排列紊乱,荧光明显模糊减弱,组间比较差异有统计学意义(P<0. 05); Mock及Sh-nc组与空白组无明显差异;(2)划痕愈合实验、Transwell实验结果显示:PODXL敲低、抑制ezrin磷酸化后足细胞迁移较其他三组减慢;(3)流式细胞仪结果显示:PODXL敲低、抑制ezrin磷酸化后足细胞凋亡率增加;(4) western印迹法和RT-qPCR检测结果显示:与正常组相比,Si组PODXL表达明显下调,同时p-ezrin表达下调,Mock及Sh-nc组与空白组无明显差异;(5) G-LISA法检测细胞中RhoA活性,结果显示:Si组、ezrin抑制组与正常组相比RhoA活性明显下降,Mock及Sh-nc组与空白组无明显差异。结论:敲低PODXL基因或抑制ezrin磷酸化后,p-ezrin表达下调、RhoA活性降低,导致足细胞骨架结构紊乱、促进足细胞凋亡。表明PODXL基因敲低后引起足细胞损伤可能与p-ezrin、RhoA信号通路有关。

关键词：足细胞细胞骨架凋亡

华支睾吸虫成虫抗原致敏树突状细胞诱导免疫应答的研究

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中国病原生物学杂志 2009年第8期4卷 582-585,F0004页

作者：戴其锋付琳琳刘宜升杜文平郑葵阳汤仁仙郭倩倩范宝峰张嫒嫒徐州医学院病原生物学教研室江苏徐州221000

目的研究华支睾吸虫成虫虫体抗原(CA)致敏树突状细胞(DCs)诱导免疫应答的类型。方法利用rm-GMCSF诱导分化BALB/c小鼠骨髓细胞获得DCs,倒置显微镜和透射电镜观察DCs形态;CA致敏DCs,检测IL-12p70水平;将致敏后的DCs和淋巴细胞共培养,用CC... 详细信息

目的研究华支睾吸虫成虫虫体抗原(CA)致敏树突状细胞(DCs)诱导免疫应答的类型。方法利用rm-GMCSF诱导分化BALB/c小鼠骨髓细胞获得DCs,倒置显微镜和透射电镜观察DCs形态;CA致敏DCs,检测IL-12p70水平;将致敏后的DCs和淋巴细胞共培养,用CCK-8试剂盒检测淋巴细胞增殖,用ELISA试剂盒检测IFN-γ和IL-4水平。结果倒置显微镜和透射电镜下见典型的DCs,CA致敏的DCs分泌高水平IL-12p70;共培养后,淋巴细胞明显增殖,分泌的IFN-γ水平显著升高,IL-4水平与其他各组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论CA刺激后DCs被活化,诱导的免疫应答向Th1方向极化,该应答与华支睾吸虫感染早期的保护性免疫密切相关。

关键词：华支睾吸虫成虫抗原树突状细胞细胞因子

ESA刺激华支睾吸虫感染小鼠脾细胞分泌Th1/Th2的动态观察

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中国热带医学 2009年第7期9卷 1187-1189页

作者：郭倩倩付琳琳汤仁仙夏惠郑葵阳刘宜升杜文平曹磊磊赵昆戴其锋徐州医学院病原生物学教研室江苏徐州221002 蚌埠医学院病原生物学教研室安徽蚌埠233030

目的观察华支睾吸虫分泌排泄抗原(ESA)刺激感染小鼠脾脏单个核细胞Th1/Th2细胞因子的动态变化。方法双抗体夹心ELISA法检测华支睾吸虫感染后不同时间小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4的动态变化。结果自感染后1w起IFN-γ的表达量开始上... 详细信息

目的观察华支睾吸虫分泌排泄抗原(ESA)刺激感染小鼠脾脏单个核细胞Th1/Th2细胞因子的动态变化。方法双抗体夹心ELISA法检测华支睾吸虫感染后不同时间小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4的动态变化。结果自感染后1w起IFN-γ的表达量开始上升,第4w达高峰(P<0.05),此后开始下降,至第12w水平接近正常。与IFN-γ不同,IL-4的表达自感染后第1w起持续升高,直至观察结束的12w(P<0.05)。结论初步结果提示华支睾吸虫感染后急性期转向慢性期的过程中Th1/Th2细胞因子的表达经历了由Th1优势应答向Th2优势应答的转变。

关键词：华支睾吸虫分泌排泄抗原 Th1/Th2 细胞因子

Nrf2和Trx1在华支睾吸虫感染小鼠肝脏中表达的初步研究

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中国热带医学 2014年第11期14卷 1299-1301,1334页

作者：韦艳霞于倩李阳刘宜升王庆苓汤仁仙郑葵阳徐州医学院病原生物学与免疫学教研室感染与免疫实验室江苏徐州221004

目的分析华支睾吸虫感染小鼠肝脏中Nrf2和Trx1编码基因的表达情况,初步探讨Nrf2及Trx1在华支睾吸虫致病过程中的作用。方法选用健康Balb/c小鼠建立华支睾吸虫感染模型,分别在实验第0、3、5、7、10、14、21、28和35d摘除小鼠眼球采血,分... 详细信息

目的分析华支睾吸虫感染小鼠肝脏中Nrf2和Trx1编码基因的表达情况,初步探讨Nrf2及Trx1在华支睾吸虫致病过程中的作用。方法选用健康Balb/c小鼠建立华支睾吸虫感染模型,分别在实验第0、3、5、7、10、14、21、28和35d摘除小鼠眼球采血,分离血清,检测血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性;颈椎脱臼处死小鼠取肝脏,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝脏中Nrf2和Trx1的m RNA表达情况。结果与对照组相比,感染组小鼠在感染第5、7、10、14、21和35d血清ALT活性显著升高(P<0.05);分别为(19.9332±1.98180)U/L、(64.3699±14.53874)U/L、(46.7455±6.27572)U/L、(99.0038±25.34329)U/L、(46.7590±8.85478)U/L和(50.3374±14.19886)U/L。感染组小鼠抗氧化应激通路上游基因Nrf2和下游Trx1的m RNA表达升高;其中Nrf2在感染第5天升高显著(P<0.05);Trx1在感染第21d升高显著(P<0.05)。结论 Nrf2和Trx1 m RNA在华支睾吸虫感染过程中表达升高,提示Nrf2/Trx1通路可能在华支睾吸虫致病过程中发挥一定的作用。

关键词：华支睾吸虫核因子相关因子-2 硫氧还蛋白-1 天冬氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶

PSA启动子荧光素酶报告载体的建立及活性鉴定

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现代生物医学进展 2012年第20期12卷 3835-3837,3830页

作者：尤红娟郝林梁清贺厚光刘雯刘转转汤仁仙韩从辉徐州医学院病原生物学与免疫学教研室江苏徐州221004 东南大学医学院附属徐州医院江苏徐州221009

目的:建立高活性的PSA启动子荧光素酶报告载体。方法:提取前列腺癌细胞PC-3总DNA,PCR扩增出PSA启动子片段,建立PSA启动子荧光素酶重组载体PGL3-psap,通过脂质体介导将重组载体转染到前列腺癌细胞PC-3中,使用荧光素酶检测系统检测其活性... 详细信息

目的:建立高活性的PSA启动子荧光素酶报告载体。方法:提取前列腺癌细胞PC-3总DNA,PCR扩增出PSA启动子片段,建立PSA启动子荧光素酶重组载体PGL3-psap,通过脂质体介导将重组载体转染到前列腺癌细胞PC-3中,使用荧光素酶检测系统检测其活性。结果:DNA测序结果表明成功构建荧光素酶重组载体PGL3-psap,荧光素酶检测显示重组载体在前列腺癌细胞PC-3中有较强活性。结论:本研究成功构建了具有高度活性的PSA启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌的诊断和治疗提供了实验基础。

关键词： PSA启动子荧光素酶报告载体克隆