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重组结核抗原痘苗病毒Ankara株的构建及其免疫原性研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第9期28卷 812-817页

作者：楼觉人张群朱琳上海生物制品研究所第二研究室 200052

目的构建5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒，并研究其特异免疫原性。方法运用同源重组技术将含结核分泌抗原Ag85A和ESAT-6的基因片段插入痘苗病毒表达质粒p18中。重组质粒导入痘苗病毒Ankara（MVA）后构建重组痘苗病毒... 详细信息

目的构建5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒，并研究其特异免疫原性。方法运用同源重组技术将含结核分泌抗原Ag85A和ESAT-6的基因片段插入痘苗病毒表达质粒p18中。重组质粒导入痘苗病毒Ankara（MVA）后构建重组痘苗病毒，经筛选和Western blot鉴定，得到5个种类的带有结核抗原基因的重组病毒。用构建的5种重组病毒免疫小鼠，MTT法检测免疫后小鼠脾淋巴细胞对特异结核抗原的增殖反应；ELISA检测小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ的含量；结核菌素纯蛋白衍化物（PPD）皮内试验以检测重组病毒引发的针对结核抗原的特异细胞免疫应答。结果构建的5种重组病毒介导的细胞表达产物经Western blot鉴定确认相对分子质量与结核抗原一致。免疫小鼠两次后，5种重组病毒免疫组脾淋巴细胞体外与Ag85A—ESAT-6融合蛋白共培养后表现出明显的增殖活性（P〈0．01），培养上清液中IFN-γ的浓度均较同组细胞经生理盐水刺激明显增高（P〈0．05）；与空痘苗病毒或生理盐水免疫后小鼠相比，5种重组MVA免疫组脾淋巴细胞与Ag85A-ESAT-6融合蛋白共培养后同样表现出明显的增殖活性（P〈0．01），与Ag85A—ESAT-6融合蛋白共培养的细胞上清液中IFN-γ的浓度均升高（P〈0．01）。与空痘苗病毒或生理盐水免疫后小鼠相比，5种重组MVA免疫组小鼠对PPD都表现出显著的迟发型超敏反应应答（P〈0．05）。结论成功构建了5种不同类型的表达结核杆菌抗原的重组痘苗病毒疫苗，其免疫小鼠后可激发针对结核杆菌抗原的特异性细胞免疫。

关键词：结核重组痘苗病毒Ankara 疫苗免疫原性

β-TCP/HAP双相煅烧骨的制备及其在BMP-2基因给药中的应用

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生物医学工程学杂志 2003年第4期20卷 630-633页

作者：徐小良汤亭亭楼觉人郁朝锋戴尅戎上海第二医科大学附属第九人民医院骨科基因治疗研究室上海200011 美国华盛顿大学医学院骨科实验室圣路易丝美国63110

研制了一种具有天然骨结构的β-磷酸三钙（β-TCP）/羟基磷灰石（HAP）双相可吸收煅烧骨（CB），并评价其在BMP-2基因给药中作为骨髓间充质干细胞（BMSCs）载体的效果。方法包括制备双相CB，行胶原表面的涂层、X线衍射分析、扫描电镜观... 详细信息

研制了一种具有天然骨结构的β-磷酸三钙（β-TCP）/羟基磷灰石（HAP）双相可吸收煅烧骨（CB），并评价其在BMP-2基因给药中作为骨髓间充质干细胞（BMSCs）载体的效果。方法包括制备双相CB，行胶原表面的涂层、X线衍射分析、扫描电镜观察、生物力学测定，并和BMP-2基因转染的BMSCs复合植入裸鼠皮下行诱导成骨试验和羊体内吸收时间的检测。X线衍射分析发现典型的HAP和β-TCP的双相波型。扫描电镜观察显示孔径和孔隙率均与松质骨相似，胶原表面涂层后细胞在材料表面贴附优良。该CB有一定的生物力学强度和合适的生物降解性。双CB加Adv-hBMP-2转染的BMSCs能诱导裸鼠皮下大量骨痂形成，在BMP-2基因给药中是良好的细胞载体。

关键词： β-TCP HAP 煅烧骨制备 BMP-2基因给药基因疗法

重组HPV病毒样颗粒二级结构的圆二色谱法预测

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国际生物制品学杂志 2022年第6期45卷 316-319页

作者：王文伟楼觉人上海至成生物科技有限公司研发部上海200051

目的分析重组HPV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的二级结构。方法取重组HPV16、18、52、58型VLP各1批,均调整蛋白浓度至250~500μg/ml,采用圆二色谱远紫外扫描,预测重组HPV VLP的二级结构。结果重组HPV16 VLP二级结构的预测结果... 详细信息

目的分析重组HPV病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的二级结构。方法取重组HPV16、18、52、58型VLP各1批,均调整蛋白浓度至250~500μg/ml,采用圆二色谱远紫外扫描,预测重组HPV VLP的二级结构。结果重组HPV16 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.7%,反平行β折叠37.1%,平行β折叠4.5%,β转角19.2%,不规则卷曲30.3%;重组HPV18 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.9%,反平行β折叠36.9%,平行β折叠4.6%,β转角19.0%,不规则卷曲30.7%;重组HPV52 VLP二级结构的预测结果为α螺旋12.3%,反平行β折叠37.1%,平行β折叠4.7%,β转角19.0%,不规则卷曲30.2%;重组HPV58 VLP二级结构的预测结果为α螺旋11.7%,反平行β折叠35.3%,平行β折叠4.4%,β转角20.4%,不规则卷曲31.3%。结论圆二色谱法预测了重组HPV16/18/52/58型VLP的二级结构,该技术可用于重组HPV VLP的结构确证研究。

关键词：人乳头瘤病毒病毒样颗粒二级结构圆二色谱

腺病毒介导的人骨形成蛋白2基因治疗的免疫学研究

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中国修复重建外科杂志 2005年第8期19卷 635-638页

作者：徐小良戴尅戎汤亭亭严孟宁朱振安郁朝锋徐旻楼觉人上海第二医科大学附属第九人民医院骨科上海200011 美国华盛顿大学医学院骨科

目的评价机体对腺病毒介导的人骨形成蛋白2(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein2,Ad-hBMP-2)基因治疗的免疫学反应。方法崇明山羊12只,手术截去右侧胫骨中段2.1cm,制备胫骨干缺损模型,随机分为2组。将Ad-hBMP-2转染的山... 详细信息

目的评价机体对腺病毒介导的人骨形成蛋白2(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein2,Ad-hBMP-2)基因治疗的免疫学反应。方法崇明山羊12只,手术截去右侧胫骨中段2.1cm,制备胫骨干缺损模型,随机分为2组。将Ad-hBMP-2转染的山羊骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs,转染组,n=7)及未转染的MSCs(未转染组,n=5)分别植入骨缺损内。于术后4、8、16及24周摄X线片检查骨缺损愈合情况,并对治疗前后机体对腺病毒的细胞和体液免疫反应进行检测。结果X线片示,转染组4～8周,骨缺损内有连续性骨痂形成;24周,有6侧骨缺损完全愈合,部分骨髓腔再通。未转染组4～8周,骨缺损内骨痂形成较少,与骨端界限清楚;24周,仅2侧骨缺损愈合。淋巴细胞与MSCs混合培养示淋巴细胞刺激指数(stimulationindex,SI)于植入后14d升高,转染组4.213±1.278,未转染组-0.310±0.147,且差异有统计学意义(P0.05)。治疗后14、28、49和120d,转染组的血浆腺病毒中和抗体滴度分别为2.359±0.226、2.297±0.200、2.214±0.215和2.297±0.210,未转染组分别为-0.175±0.335、-0.419±0.171、0±0.171和0.874±0.524,两组各时间点差异均有统计学意义(P<0.05)。结论腺病毒介导的基因治疗可引起机体对腺病毒的细胞及体液免疫反应,从而逐渐消除腺病毒基因和相关蛋白的影响。

关键词：组织工程骨形成蛋白2基因治疗腺病毒免疫反应

压缩冲击对骨形成蛋白2基因修饰的组织工程骨的影响

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中国修复重建外科杂志 2006年第2期20卷 98-101页

作者：严孟宁汤亭亭戴戎周新社岳冰郁朝锋楼觉人上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科上海200011 美国华盛顿大学医学院骨科

目的观察直接压缩冲击对骨形成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,BMP-2)基因修饰的组织工程骨细胞存活和成骨的影响,以探讨组织工程骨压缩植骨的可行性。方法体外培养扩增犬骨髓基质干细胞(marrowstromalstemcells,MSCs)转染腺病毒介导... 详细信息

目的观察直接压缩冲击对骨形成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,BMP-2)基因修饰的组织工程骨细胞存活和成骨的影响,以探讨组织工程骨压缩植骨的可行性。方法体外培养扩增犬骨髓基质干细胞(marrowstromalstemcells,MSCs)转染腺病毒介导的人BMP-2(adenovirusmediatedhumanBMP-2,Adv-hBMP-2)基因,与颗粒状的犬异体冻干松质骨复合。复合后4d进行模拟压缩实验,分别于复合后24h、4d,压缩后即刻、1、4d以扫描电镜观察细胞形态及数量。将单纯冻干骨、未经压缩的Adv-hBMP-2基因修饰的组织工程骨和压缩后4d的Adv-hBMP-2基因修饰的组织工程骨植入裸鼠背部皮下,于术后6周行组织学观察新骨形成及冻干骨吸收情况。结果复合24h冻干骨表面细胞展开,部分孔隙可见单层细胞生长;4d后冻干骨表面细胞复层生长,胶原量多;压缩后即刻,冻干骨与冲击器接触的外表面基本无细胞存在,剖开面可见细胞片状掀起,碎片多;压缩后1d,冻干骨表面细胞大部分脱落掀起,形成较多的细胞碎片;4d后细胞数量明显减少,胶原分泌量增多。植入裸鼠背部皮下后,单纯冻干骨新骨形成极少,孔隙内主要为纤维组织,未经压缩的Adv-hBMP-2基因的组织工程骨组可见大量新骨形成,材料中心与周围新骨分布均匀,压缩后的Adv-hBMP-2基因的组织工程骨组新骨量明显减少,且主要在外周。结论体外模拟压缩植骨可明显减少基因修饰的组织工程骨中的细胞存活及体内成骨,但存活细胞的功能仍存在,可适用于压缩植骨重建假体周围骨缺损。

关键词：组织工程骨腺病毒骨形成蛋白2 压缩冲击骨形成

利用毕赤酵母表达系统表达兔出血症病毒样颗粒及其免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2019年第3期41卷 300-304页

作者：尹曼曼楼觉人上海海利生物技术股份有限公司/上海市兽用生物制品工程技术中心上海奉贤201403

为研究毕赤酵母表达的兔病毒性出血症病毒(RHDV)病毒样颗粒(VLP)的免疫保护性,本研究将RHDV VP60的基因克隆到pPIC3.5K载体中,并导入毕赤酵母KM71菌株中,重组菌株经发酵和甲醇诱导,通过western blot检测目的蛋白的表达;透射电镜观察表... 详细信息

为研究毕赤酵母表达的兔病毒性出血症病毒(RHDV)病毒样颗粒(VLP)的免疫保护性,本研究将RHDV VP60的基因克隆到pPIC3.5K载体中,并导入毕赤酵母KM71菌株中,重组菌株经发酵和甲醇诱导,通过western blot检测目的蛋白的表达;透射电镜观察表达产物是否组装形成VLP;并通过动物试验评估VLP的免疫原性和攻毒保护效果。Western blot结果显示VP60蛋白能够在酵母内表达,电镜下观察到表达的VP60能够自发装配成大小均一的颗粒,与天然RHDV大小相当,约为30 nm～40 nm,表明表达的VP60可以自发组装成VLP。动物实验结果表明:表达的VLP与佐剂MONTANIDE GEL 01 PR混合后免疫实验兔,能够刺激实验兔产生保护性抗体,免疫后21 d攻毒,对实验兔的保护率达100%,且保护性抗体至少可以持续6个月。本研究利用毕赤酵母表达了RHDV的VLP,为研制RHDV亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：兔病毒性出血症病毒毕赤酵母 VP60蛋白病毒样颗粒

重组结核抗原痘苗病毒免疫次数和免疫途径对免疫原性的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第10期28卷 939-940页

作者：楼觉人张群朱琳上海生物制品研究所第二研究室 200052

卡介苗（BCG）是目前用于预防结核病的惟一疫苗，但其对成年人结核病的预防效果不理想。本研究前期工作已构建了5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒，其免疫小鼠2次后均可激发针对结核杆菌抗原的特异性细胞免疫。然而，... 详细信息

卡介苗（BCG）是目前用于预防结核病的惟一疫苗，但其对成年人结核病的预防效果不理想。本研究前期工作已构建了5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒，其免疫小鼠2次后均可激发针对结核杆菌抗原的特异性细胞免疫。然而，重组安卡拉痘苗病毒（MVA）是一活的病毒载体，此重组病毒是否能多次免疫动物以及多次免疫动物后能否产生更有效的免疫反应尚不清楚。此外，用重组MVA经不同途径免疫小鼠，

关键词：重组痘苗病毒免疫原性免疫途径免疫次数结核抗原特异性细胞免疫安卡拉痘苗病毒表达结核杆菌

骨形成蛋白2基因修饰的老年大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

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中国修复重建外科杂志 2006年第1期20卷 53-57页

作者：岳冰陈燕飞汤亭亭陆斌郁朝锋楼觉人戴戎上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科太原师范学院生物系美国华盛顿大学医学院骨科实验室

目的观察年龄因素对骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)成骨分化能力的影响;了解基因治疗对老年大鼠MSCs成骨分化能力的影响。方法1月龄(幼年组)、9月龄(成年组)及24月龄(老年组)雄性Wistar大鼠各6只,取MSCs经体外分离... 详细信息

目的观察年龄因素对骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)成骨分化能力的影响;了解基因治疗对老年大鼠MSCs成骨分化能力的影响。方法1月龄(幼年组)、9月龄(成年组)及24月龄(老年组)雄性Wistar大鼠各6只,取MSCs经体外分离、培养及携带骨形成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,BMP-2)基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2)转染后,定量检测BMP-2、碱性磷酸酶(alkalinephosphate,ALP)表达,以及成骨细胞标志性蛋白:型胶原、骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP)和骨桥素(osteopontin,OPN)的表达。将转染的各组MSCs分别与磷酸三钙(tricalciumphosphate,TCP)复合后植入裸鼠体内,3周后取材,比较各组诱导异位成骨能力。结果ELISA检测表明BMP-2基因修饰的MSCs可以有效表达BMP-2,且表达量在各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05);各组ALP于诱导后第9天达高峰,但组间差异均无统计学意义(P>0.05);诱导后第7天,RT-PCR半定量检测示各组均有成骨细胞特征性蛋白,即:型胶原、OPN及BSP的明显表达,表达量在各组间差异无统计学意义(P>0.05);BMP-2基因转染的MSCs与TCP复合后可诱导裸鼠体内异位成骨,各组成骨量差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMP-2基因修饰的老年大鼠MSCs可以恢复成骨分化能力,基因治疗可能为老年性骨骼疾病提供一种新的治疗途径。

关键词：老年骨髓间充质干细胞骨形成蛋白2 基因治疗大鼠

重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

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中国生物制品学杂志 2010年第11期23卷 1153-1157页

作者：张群朱琳楼觉人上海生物制品研究所第二研究室上海200052

目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂... 详细信息

目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化复性后,在体外对经5种不同类型的表达结核杆菌Ag85a和ESAT6的重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞进行刺激,以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应。结果重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约41000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的55.65%;纯化复性的重组融合蛋白纯度达95%以上,表达量约为1.2g/L发酵液,且具有良好的反应原性;与空痘苗病毒或生理盐水免疫的小鼠相比,5种重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞与Ag85a-ESAT6融合蛋白共培养后,增殖活性明显升高(P<0.01)。结论成功利用原核系统表达了结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,纯化复性的Ag85a-ESAT6融合蛋白具有生物学活性。

关键词：分枝杆菌,结核 Ag85a ESAT6 原核细胞基因表达生物活性