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芹菜素诱导结肠癌发生免疫原性细胞死亡的实验研究

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芹菜素诱导结肠癌发生免疫原性细胞死亡的实验研究

作者：梁莉芳广东药科大学

学位级别：硕士

目的:探究天然黄酮类化合物芹菜素（Apigenin,API）对结肠癌的抑制作用、对结肠癌发生免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）的影响以及相关的作用机制,为API作为抗肿瘤治疗的免疫调节剂提供实验依据。方法:（1）人肝细胞系Lo... 详细信息

目的:探究天然黄酮类化合物芹菜素（Apigenin,API）对结肠癌的抑制作用、对结肠癌发生免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）的影响以及相关的作用机制,为API作为抗肿瘤治疗的免疫调节剂提供实验依据。方法:（1）人肝细胞系Lo2经6.25μM～200μM的API处理,MTT法检测API对Lo2细胞活力的影响;人结肠癌细胞系Lo Vo和小鼠结肠癌细胞系CT26分别经3.12μM～200μM和4.68μM～300μM的API处理,MTT法检测癌细胞的存活率;集落形成实验检测API对Lo Vo和CT26细胞增殖的影响;凋亡和凋亡相关分子分别由流式细胞术和Western blot分析。（2）25μM～100μM和50μM～200μM的API分别处理Lo Vo和CT26细胞,免疫荧光和Western blot同时检测ICD相关分子HMGB1、CALR、HSP70、HSP90和MHC-Ⅰ的表达;Western blot检测MAPK-p38和NF-κB-p65及其磷酸化的蛋白表达;MAPK-p38抑制剂作用于CT26细胞,Western blot检测ICD相关分子的表达变化;经API预处理的Lo Vo细胞与Jurkat T细胞共培养,MTT法检测Lo Vo细胞的存活率。（3）构建小鼠和裸鼠两种皮下移植瘤模型,分别随机设立为生理盐水对照组、API低剂量（50 mg/kg）组、API中剂量（100 mg/kg）组、API高剂量（200 mg/kg）组和5-Fu阳性药物组等干预组;观察API干预后荷瘤鼠的体重、移植瘤的生长和免疫器官指数等变化;采用H&E染色检测API干预对移植瘤组织的影响。（4）采用免疫组化法分析两种移植瘤中CALR、MHC-Ⅰ、p-MAPK-p38和p-NF-κB-p65的表达;Western blot检测小鼠移植瘤中ICD相关分子和MHC-Ⅰ的蛋白表达;Western blot检测小鼠移植瘤中MAPK-p38和NF-κB-p65及其磷酸化蛋白表达变化;免疫组化法检测小鼠移植瘤中CD8T淋巴细胞的数量变化。结果:（1）API对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响API在6.25μM～200μM浓度范围内对Lo2无细胞毒性。3.125μM～200μM和4.68μM～300μM的API分别对Lo Vo和CT26细胞的增殖具有抑制作用,48 h的IC50分别为45.65μM和83.64μM。与对照组相比,经API处理后的Lo Vo和CT26细胞凋亡率升高,凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低。（2）API诱导结肠癌细胞发生ICD与MAPK-p38和NF-κB-p65信号调控有关与对照组相比,经API处理的Lo Vo和CT26细胞ICD相关分子和MHC-Ⅰ的荧光信号表达增强,蛋白表达升高。p-MAPK-p38的蛋白表达升高,p-NF-κB-p65的蛋白表达降低。与API单独处理组相比,MAPK-p38抑制剂和API共同处理组的MAPK-p38及其磷酸化表达均被抑制,ICD相关分子的蛋白表达显著降低。与经API单独处理的Lo Vo细胞相比,与Jurkat T细胞共培养的癌细胞存活率出现降低。（3）API干预对结肠癌移植瘤的影响API干预对结肠癌移植瘤小鼠和裸鼠体重变化无明显影响。与对照组相比,API干预使移植瘤生长缓慢,瘤体积减小;小鼠脾脏和胸腺指数提高;移植瘤组织凋亡坏死区域增多。（4）API诱导结肠癌移植瘤发生ICD可能与MAPK-p38和NF-κB-p65信号调控有关组化实验表明,与对照组相比,API干预后移植瘤中CALR、MHC-Ⅰ和p-MAPK-p38的表达增强,p-NF-κB-p65表达减少。Western blot实验表明,小鼠移植瘤中ICD相关分子和MHC-Ⅰ的蛋白表达均显著升高,同时p-MAPK-p38的蛋白表达上调,而p-NF-κB-p65蛋白表达下调。与对照组相比,API干预后小鼠移植瘤组织中CD8T淋巴细胞增多。结论:API抑制结肠癌的增殖并促进其凋亡的发生,诱导HMGB1、CALR、HSP70和HSP90等ICD分子以及MHC-Ⅰ的表达升高,并促进肿瘤组织中CD8T淋巴细胞增多,其中MAPK-p38和NF-κB-p65信号可能在ICD的发生过程中发挥重要作用。提示API可能是一种用于结肠癌治疗的新型免疫调节剂。

关键词：芹菜素免疫原性细胞死亡细胞凋亡结肠癌信号通路

黄酮类化合物和抗生素类药物的高效液相色谱检测技术研究

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黄酮类化合物和抗生素类药物的高效液相色谱检测技术研究

作者：梁莉芳西南大学

学位级别：硕士

化学发光(chemiluminescence，简称CL)是化学反应的反应物或是生成物吸收了反应过程中释放的化学能，电子由基态跃迁至激发态，再由激发态返回基态时所产生的光辐射，根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定反应中的响... 详细信息

化学发光(chemiluminescence，简称CL)是化学反应的反应物或是生成物吸收了反应过程中释放的化学能，电子由基态跃迁至激发态，再由激发态返回基态时所产生的光辐射，根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定反应中的响应组分含量的分析方法叫做化学发光分析法。此法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、分析快速等优点。化学发光检测亦可与高效的分离手段如：高效液相色谱、毛细管电泳等联用，有效克服化学发光分析法固有的选则性差的缺点，成为一种有效的痕量分析方法，在环境科学、药物分析及生命科学等领域中具有广泛的应用前景。将具有高分离效率的高效液相色谱(HPLC)分离法与具有高灵敏度的化学发光分析法相结合已引起了国内外分析化学家的极大关注，成为从上个世纪80年代末至今分析化学研究的一大热点。毫无疑问，高效液相色谱分离技术与化学发光检测法的联用将在生物、临床医学、环境检测、药物分析等领域得到愈来愈广泛的应用。本文包括两个部分。第一部分是综述，这部分结合化学发光分析法，评述了近十年高效液相色谱及其与化学发光柱后检测技术在黄酮类化合物和抗生素类药物中的应用。第二部分是研究报告。第一节是高效液相色谱化学发光检测法在黄酮类化合物中的研究。详细研究了在碱性条件下，铁氰化钾氧化鲁米诺产生化学发光，而漆黄素能增强发光信号，从而建立了简单、灵敏、快速测定漆黄素高效液相色谱化学发光新方法。第二节是高效液相色谱检测技术在抗生素类药物中的应用。研究了在C反相色谱柱，采用UV-VIS检测器，磷酸二氢钾-磷酸(pH 4．0)缓冲液为流动相于211 nm下检测新型抗生素中间体S-AMOSA;并研究了FMOC柱前衍生法测定S-AMOSA，以9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)为衍生剂，与S-AMOSA发生衍生反应后，反相高效液相色谱法测定的方法。本法快速、简单、准确度高，适用于测定新型抗生素中间体S-AMOSA。 1．漆黄素的高效液相色谱化学发光检测法研究本文研究发现，漆黄素在碱性条件下能大大增强Luminol-KF(CN)化学发光强度，基于此，并结合HPLC分离技术，建立起漆黄素的HPLC-CL分析新方法。在C反相键合相色谱柱，甲醇为流动相的条件下，实现了对人体血清中的漆黄素的分离与测定，方法的线性范围为7．7×10～9．6×10g／L，相关系数为r=0．9998，检出限为2．7×10g／L，RSD为2．41％(n=11)。实验表明该法快速、简单、准确度高，适用于漆黄素的测定。 ***-HPLC法测定新型抗生素中间体S-AMOSA 建立快速、灵敏的反相高效液相色谱法测定新型抗生素中间体S-AMOSA的浓度。采用岛津SPD-6AV检测器，Hypersil C(150 mm×4．6 mm，5．0μm)色谱柱，磷酸二氢钾-磷酸(pH 4．0)缓冲液为流动相，柱温为室温时，于211 nm波长处以外标法测定。结果表明S-AMOSA在4．8～120μg／mL的范围内呈良好的线性关系(r=0．9999)。方法回收率为98．0％～103．0％。实验表明该法简便、快速、有效，重现性好，首次用于抗生素中间体S-AMOSA的测定，取得了很好的结果。 ***柱前衍生-高效液相色谱法测定新型抗生素中间体S-AMOSA 建立FMOC柱前衍生测定新型抗生素中间体S-AMOSA的高效液相色谱方法。以9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)为衍生剂，与S-AMOSA发生衍生反应后，反相高效液相色谱法测定。以甲醇-水为流动相，C柱为分离柱，紫外可见检测器(263 nm)检测。结果表明S-AMOSA在0．01125～0．36 g／L的范围内呈良好的线性关系(r=0．9996)。方法回收率为97．78％～102．33％。实验表明该法快速、简单、准确度高，适用于新型抗生素中间体S-AMOSA的测定。 ***-HPLC法分离测定动物肝脏中多种维生素的含量建立了一种同时测定4种水溶性维生素的高效液相色谱方法。采用Shimadzu VP-ODS(150mm×4．6 mm i．d．，5．0μm)色谱柱，以甲醇-0．01 mol／L磷酸氢二钾缓冲溶液梯度洗脱，在波长为267 nm处进行检测。维生素C、B、B和B分别在22．3～116．0，2．4～152．5，2．2～340．0，1．7～272．0μg／mL呈良好的线性关系，相对标准偏差为(n=6)1．14％～1．56％，平均回收率在98．6～102．3％范围以内。实验表明该方法可用于同时测定动物肝脏中维生素C、B、B和B的含量。

关键词：高效液相色谱化学发光黄酮抗生素

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漆黄素的高效液相色谱化学发光检测法研究

西南大学学报（自然科学版） 2008年第7期30卷 47-50页

作者：梁莉芳周光明黄成西南大学化学化工学院重庆400715

研究发现，漆黄素在碱性条件下能大大增强Luminol-K3Fe（CN）6化学发光强度，基于此，并结合HPLC分离技术，建立起漆黄素的HPLC-L分析新方法。在C18反相键合相色谱柱，甲醇为流动相的条件下，实现了对人体血清中的漆黄素的分离与测定，... 详细信息

研究发现，漆黄素在碱性条件下能大大增强Luminol-K3Fe（CN）6化学发光强度，基于此，并结合HPLC分离技术，建立起漆黄素的HPLC-L分析新方法。在C18反相键合相色谱柱，甲醇为流动相的条件下，实现了对人体血清中的漆黄素的分离与测定，方法的线性范围为7．7×10^-6～9．6×10^-4g／L，相关系数为r=O．9998，检出限为2.7×10^-7g／L，相对标准偏差为2．41％（n=11）。

关键词：化学发光高效液相色谱人体血清漆黄素

标准曲线法测定高纯工艺试剂盐酸中痕量金属杂质

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湖南有色金属 2017年第2期33卷 73-75页

作者：梁莉芳株洲冶炼集团股份有限公司湖南株洲412004

试验研究建立了高纯工艺中重要试剂盐酸中痕量杂质的分析方法。试样经过蒸发浓缩,挥发除去水和挥发性试剂,保持亚沸状态蒸干。残渣用硝酸溶解,用ICP-MS进行测定,可同时测定Na、Mg、Al、K、Ca、Fe、Ni、Cu、Zn、Cd、Ag、Sb、Pb、Bi等杂... 详细信息

试验研究建立了高纯工艺中重要试剂盐酸中痕量杂质的分析方法。试样经过蒸发浓缩,挥发除去水和挥发性试剂,保持亚沸状态蒸干。残渣用硝酸溶解,用ICP-MS进行测定,可同时测定Na、Mg、Al、K、Ca、Fe、Ni、Cu、Zn、Cd、Ag、Sb、Pb、Bi等杂质元素。

关键词： ICP-MS 盐酸标准曲线法

O-羧甲基化壳聚糖修饰磁性Fe_3O_4纳米粒子及其生物应用

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功能材料 2008年第7期39卷 1199-1201页

作者：陈丽娜周光明薛莲刘兰梁莉芳曾献生盛蓉生西南大学化学与生化学院重庆400715 西南大学生命科学学院重庆400715 卡南吉医药技术(上海)有限公司上海201203

采用共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子,用XRD测定粒子成分,用透射电镜和显微镜观测粒子形貌,用震动样品磁场计测定Fe3O4粉末饱和磁化强度,再以O-羧甲基化壳聚糖修饰后,用红外光谱检测粒子成分。粒子性能良好,能很好的应用于生物分离,连接等。

关键词： O-羧甲基壳聚糖磁性Fe3O4纳米粒子蛋白

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用数理统计方法进行试卷分析

上饶师范学院学报 2002年第6期22卷 10-13页

作者：马江山梁莉芳上饶师范学院江西上饶334001

针对试卷的难度、区分度、信度、效度几个方面 ,就如何运用数理统计方法分析试卷质量进行了初步探讨。

关键词：难度区分度信度

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火焰原子吸收光谱法测定铋锭中的铜量

湖南有色金属 2017年第3期33卷 73-75页

作者：梁莉芳王欢株洲冶炼集团股份有限公司湖南株洲412004

介绍了用硝酸低温溶解试样,在稀酸介质中,于原子吸收光谱仪波长324.7 nm处,使用空气-乙炔火焰测定铜的含量。在最佳的试验条件下,在标准控制范围内铜的质量浓度与吸光度线性关系良好,加标回收率为97.0%~101.5%,测定铋锭中的铜相对标准... 详细信息

介绍了用硝酸低温溶解试样,在稀酸介质中,于原子吸收光谱仪波长324.7 nm处,使用空气-乙炔火焰测定铜的含量。在最佳的试验条件下,在标准控制范围内铜的质量浓度与吸光度线性关系良好,加标回收率为97.0%~101.5%,测定铋锭中的铜相对标准偏差较小,测定结果准确度好、精密度高,此方法可靠、准确、操作简便。

关键词：铋锭铜火焰原子吸收光谱法

RP-HPLC法分离测定动物肝脏中多种维生素

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分析试验室 2008年第1期27卷 53-56页

作者：梁莉芳周光明黄成刘兰陈丽娜西南大学化学化工学院重庆4000715

建立了一种同时测定4种水溶性维生素的高效液相色谱方法。采用ShimadzuVP-ODS（150mm×4．6mm i．d．，5．0μm）色谱柱，以甲醇-0．05mol／L磷酸氢二钾缓冲溶液梯度洗脱，在波长为267nm处进行检测。维生素C、B1、B6和B2分别在22．3～11... 详细信息

建立了一种同时测定4种水溶性维生素的高效液相色谱方法。采用ShimadzuVP-ODS（150mm×4．6mm i．d．，5．0μm）色谱柱，以甲醇-0．05mol／L磷酸氢二钾缓冲溶液梯度洗脱，在波长为267nm处进行检测。维生素C、B1、B6和B2分别在22．3～116．0，2．4～152．5，2．2～340．0，1．7～272．0μg／mL呈良好的线性关系，相对标准偏差为（n=6）1．1％～1．6％，平均回收率在98．6％～102．3％范围以内。可用于同时测定动物肝脏中维生素C、B1、B6和B2。

关键词：动物肝脏水溶性维生素高效液相色谱法

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毛毛虫与腾飞龙:《云四坪》的共创之路

开放时代 2024年第2期 F0002-F0002,F0003页

作者：梁莉无不详屏南乡村振兴研究院

让新村民和老村民共同创作一首村歌,会是一种怎样的体验?跨代际交流?新旧观念碰撞?质疑与理解交错?感动与争论并存?位于福建省屏南县熙岭乡的四坪村曾经是个只剩下十几个留守老人的“空心村”,乡贤潘国建清晰地记得2021年7月参加村歌工... 详细信息

让新村民和老村民共同创作一首村歌,会是一种怎样的体验?跨代际交流?新旧观念碰撞?质疑与理解交错?感动与争论并存?位于福建省屏南县熙岭乡的四坪村曾经是个只剩下十几个留守老人的“空心村”,乡贤潘国建清晰地记得2021年7月参加村歌工作坊的场景。

关键词：工作坊村歌留守老人新旧观念毛毛虫空心村福建省屏南县代际交流