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哈茨木霉酸性蛋白酶基因的克隆表达及其水解应用

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现代食品科技 2024年

作者：陈宇琛杨李谷敏陈凯欣胡秋怡邱小娴彭靖怡柯野韶关学院生物与农业学院仲恺农业工程学院资源与环境学院

为了对哈茨木霉酸性蛋白酶(Acid Protease,Ap)的性质研究，采用RT-PCR克隆了哈茨木霉Ap基因，转化至毕赤酵母GS115菌株中获得高效表达，然后对该重组蛋白酶(Recombinant Acid Protease,r Ap)的酶学性质和水解大豆分离蛋白的效果进行测... 详细信息

为了对哈茨木霉酸性蛋白酶(Acid Protease,Ap)的性质研究，采用RT-PCR克隆了哈茨木霉Ap基因，转化至毕赤酵母GS115菌株中获得高效表达，然后对该重组蛋白酶(Recombinant Acid Protease,r Ap)的酶学性质和水解大豆分离蛋白的效果进行测定。结果表明，重组毕赤酵母在500 mL三角瓶中诱导表达时，发酵液中r Ap酶活力达到21.50 U/mL。该r Ap为天冬氨酸蛋白酶，最适温度为55℃，在40℃处理120 min仍具有较强的热稳定性；最适p H值为2.50，在不同p H缓冲液中处理24 h后，p H值2.00～5.00具有较强稳定性。Cu2+、Ni2+和Mn2+能显著促进活性，相对酶活分别高达116.21%±8.13%、113.79%±6.74%和117.44%±3.46%；而Fe2+、Fe3+、0.50%SDS和5.00%Trion X-100显著抑制活性，其相对酶活分别78.02%、79.26%、2.6%和13.19%。r Ap和胃蛋白酶对大豆分离蛋白水解后，水解产物中蛋白相对含量分别为14.67%和3.64%,β-伴大豆球蛋白抗原性分别降低了30.01%和26.10%，球蛋白抗原性分别降低了22.37%和15.63%。从以上结果可知，r Ap对大豆分离蛋白具有较强水解和降低抗原性的能力，具有潜在的应用开发价值。

关键词：哈茨木霉酸性蛋白酶酶学性质大豆分离蛋白水解作用

棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达及其对大豆分离蛋白的水解

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食品科学 2023年第20期44卷 175-182页

作者：周迪邱小娴柯野胡秋怡韶关学院英东生物与农业学院广东韶关512005

为开发木霉天冬氨酸蛋白酶的应用潜能,采用实时聚合酶链式反应技术,从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)中克隆蛋白酶基因asp,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中成功表达,进一步对重组蛋白酶rAsp进行分离纯化,分析其生化特性及对大... 详细信息

为开发木霉天冬氨酸蛋白酶的应用潜能,采用实时聚合酶链式反应技术,从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)中克隆蛋白酶基因asp,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中成功表达,进一步对重组蛋白酶rAsp进行分离纯化,分析其生化特性及对大豆分离蛋白的水解作用。结果显示,asp基因编码的蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶家族,其序列与本家族成员序列相似性最高为47.74%。在三角瓶中诱导表达时,发酵液中rAsp的酶活力为25.8 U/mL。rAsp最适反应pH值和温度分别为2.5和45℃,在pH 2.0~6.0范围和45℃以下具有较强的稳定性。Cu^(2+)和Mn2+具有促进rAsp活性的作用,而Fe^(3+)、十二烷基硫酸钠和胃蛋白酶抑制剂显著抑制rAsp的活性。rAsp对大豆分离蛋白的水解效率较商业化胃蛋白酶高7.7%;同时,降低β-伴大豆球蛋白和球蛋白致敏性的能力分别是胃蛋白酶的1.4倍和1.8倍。因此,rAsp在大豆蛋白加工应用中具有潜在的开发价值。

关键词：棘孢木霉重组天冬氨酸蛋白酶生化特性大豆分离蛋白致敏性

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地方本科高校产教融合研究述评与展望

教书育人:高教论坛 2023年第8期 4-9页

作者：涂智苹柯野韶关学院商学院韶关学院生物与农业学院

产教融合办学模式是地方本科高校实现应用型人才培养目标的重要途径。通过定量和定性分析归纳总结,学者们认为当前地方本科高校产教融合办学存在认识不到位、合作内容不深入、双师型教师缺乏以及相关保障措施不足等问题。对此,学者们从... 详细信息

产教融合办学模式是地方本科高校实现应用型人才培养目标的重要途径。通过定量和定性分析归纳总结,学者们认为当前地方本科高校产教融合办学存在认识不到位、合作内容不深入、双师型教师缺乏以及相关保障措施不足等问题。对此,学者们从学校、企业和政府三个层面提出要提高产教融合办学认识、重构课程体系和建设实践实训平台、提高双师型师资水平以及完善学校、企业和政府三方的保障措施等建议,以期提高产教融合办学质量,做到人才供需无缝对接。在此基础上,提出未来应进一步增强产教融合办学意识、理顺相关利益者关系以及完善和落实相关保障措施等建议。

关键词：地方本科高校产教融合述评展望

羽毛降解菌Deinococcus actinosclerus RM的分离、鉴定及其产生的蛋白酶酶学性质

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福建农林大学学报（自然科学版） 2022年第1期51卷 98-103页

作者：柯野谢天涵梅颖诗张敏黄湘屈奇奇韶关学院英东生物与农业学院广东韶关512005

从羽毛废弃物的排水沟污泥中采集污泥样品,通过富集培养、分离、纯化、发酵筛选,获得一株降解羽毛效果最佳的RM菌株.对该菌株进行形态特征、16S rDNA序列以及生理生化试验初步鉴定RM菌株为Deinococcus actinosclerus.该菌株在4%羽毛含... 详细信息

从羽毛废弃物的排水沟污泥中采集污泥样品,通过富集培养、分离、纯化、发酵筛选,获得一株降解羽毛效果最佳的RM菌株.对该菌株进行形态特征、16S rDNA序列以及生理生化试验初步鉴定RM菌株为Deinococcus actinosclerus.该菌株在4%羽毛含量条件下,培养7 d后对羽毛的降解率高达60%,且羽毛水解产物含有多种氨基酸,如丝氨酸、天冬氨酸.RM菌株产生的胞外蛋白酶以丝氨酸蛋白酶为主,也含有天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶.粗酶液最适反应温度为45℃,最适pH为10.0;金属离子Cu^(2+)、Mg^(2+)能够提高蛋白酶活性,而Ca^(2+)、Ni^(2+)、Zn^(2+)及蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、亮抑蛋白酶肽对酶活性有抑制作用.通过以上结果可知,RM菌株对羽毛的高效降解具有较高的潜在应用价值.

关键词：羽毛降解 Deinococcus actinosclerus RM菌株分离鉴定酶学性质

长根金钱菌发酵条件及其发酵液对玉米小斑病菌拮抗作用的研究

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长根金钱菌发酵条件及其发酵液对玉米小斑病菌拮抗作用的研究

作者：柯野四川农业大学

学位级别：硕士

通过几种食用菌，川耳1号(Auricularia fuscosucciuea)、蘑菇2796(Agaricus bisporus)、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、金针菇(Flammulina velutipes)、香菇类的武香(Lentinu edodes)、草菇V2039(Lentinu edodes)、赤芝(Ganoderma lucidum)、茯苓(Poria cocos)、长根菇(Oudenmansiella radicata)、姬松茸(Agaricus blazei)与植物病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、稻瘟病菌(Pyricularis grisea)、丝核菌(Rhizoctonia solani)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)等病原菌的对峙培养试验。试验结果表明，长根金钱菌和川耳1号对玉米小斑病菌有很强的拮抗作用;长根金钱菌对水稻稻瘟病菌也有很强的拮抗作用。在此基础上，通过菌丝间的相互作用观察、对扣试验和马铃薯蔗糖发酵液对病原菌菌丝生长抑制作用等项研究表明：只有长根金钱菌的发酵液对玉米小斑病菌菌丝生长有抑制作用。因此选择长根金钱菌作为对玉米小斑病菌的生防菌株进行了进一步的研究。长根金钱菌不同的C/N试验和正交试验可知：最适合长根金钱菌菌丝生长的C/N为10～20：1，最适培养基是玉米粉4％、蔗糖1％、黄豆粉1.5％、蛋白胨0.2％和初始pH7;并且玉米粉、蔗糖、黄豆粉、蛋白胨和初始pH各因素对菌丝生长的影响依次减弱。菌丝生长曲线表明，5～10天菌丝生长速度最快，此阶段的菌丝体是最好的液体菌种，15天菌丝生物量达到最大。通过正交试验不同处理的发酵液对玉米小斑病菌菌丝生长的抑制作用结果证明：培养基是玉米粉4％、蔗糖3％、黄豆粉0.5％、蛋白胨0.2％和初始pH6时，发酵液对玉米小斑病菌菌丝生长的抑制作用最强，且初始pH、蔗糖、蛋白胨、黄豆粉和玉米粉各因素对玉米小斑病菌菌丝生长的抑制作用依次减小。发酵液对玉米小斑病菌菌丝生长的抑制率与长根金钱菌的生物量呈正相关，回归方程是y=-42.498+23.88868x，相关系数r=0.998*。长根金钱菌培养14天，发酵液中抗菌物质的量达到最大，发酵液中粗蛋白对玉米小斑病菌菌丝生长有极显著的抑制作用，但是粗多糖对玉米小斑病菌菌丝生长没有抑制作用。该发酵液对分生孢子的萌发有极显著的抑制作用，几乎相当于百菌清或多菌灵稀释液对孢子萌发的抑制作用。发酵液中的拮抗物质有较强的热稳定性。通过玉米盆栽试验结果表明：发酵液对玉米小斑病菌分生孢子侵染玉米叶片有显著的抑制作用。

关键词：长根金钱菌,玉米小斑病菌,拮抗作用,培养条件

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哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的结构分析

韶关学院学报 2022年第6期43卷 55-60页

作者：柯野屈奇奇李昊然韶关学院英东生物与农业学院广东韶关512005

利用生物信息学网站、软件对哈茨木霉酸性蛋白酶P6281进行了预测和分析.结果表明,P6281属于Clan AA中A1家族的天冬氨酸蛋白酶,一级结构是由386个氨基酸残基组成的序列,其中序列的氨基酸残基1~17位为信号肽、18~65位为前导肽、66~386位... 详细信息

利用生物信息学网站、软件对哈茨木霉酸性蛋白酶P6281进行了预测和分析.结果表明,P6281属于Clan AA中A1家族的天冬氨酸蛋白酶,一级结构是由386个氨基酸残基组成的序列,其中序列的氨基酸残基1~17位为信号肽、18~65位为前导肽、66~386位为成熟肽.以来源于Irpex lacteus的天冬氨酸蛋白酶(PDB code:1wkr.1.A)为模板进行同源建模;从构建的P6281模型中可知,P6281二级结构主要由β折叠以及少量的简短α螺旋结构组成.三级结构由类二重对称的N-lobe和C-lobe形成,该结构中无丝氨酸和脯氨酸形成的顺式肽键、loop环中无脯氨酸残基、无Zn离子结合、含有1个二硫键、270个氢键.N-lobe和C-lobe相结合的缝隙即为P6281的底物结合区域(分为S2’、S1’、S1、S2、S3和S4),其中S1’、S1、S3和S4对其底物选择性具有关键性作用;并且底物结合区域中重要位点的氨基酸残基的保守性和差异性,决定了P6281对底物肽键选择性的独特性.

关键词：哈茨木霉酸性蛋白酶P6281 结构分析

总状毛霉丝氨酸蛋白酶基因结构和功能的生物信息学分析

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2012年第4期38卷 370-376页

作者：柯野曾松荣郑秋桦韶关学院英东生命科学学院广东韶关512005

利用PCR和RACE(cDNA末端快速扩增)技术从总状毛霉中克隆获得1个丝氨酸蛋白酶新基因,利用生物信息学方法对该基因序列、编码的酶序列以及酶性质和结构进行预测。结果表明:该基因编码区序列长1 421bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码由42... 详细信息

利用PCR和RACE(cDNA末端快速扩增)技术从总状毛霉中克隆获得1个丝氨酸蛋白酶新基因,利用生物信息学方法对该基因序列、编码的酶序列以及酶性质和结构进行预测。结果表明:该基因编码区序列长1 421bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码由429个氨基酸残基组成的多肽;对该多肽的组成和进化分析表明,其成熟肽属于蛋白酶K家族的胞外蛋白酶;通过同源建模结构分析表明,该酶没有二硫键,有152个氢键和29个盐键,酶的Glu190、Ala192和Asp215残基与一个Ca2+相结合,酶活性位点残基Asp44和Ser241溶剂可及表面积较大,分别达到0.211 42和3.309 32;该酶的底物结合区域中,S1和S4口袋结构明显,S2次之,S3最不明显,部分组成S1和S4口袋的氨基酸残基不保守,这可能使该酶具有独特的水解性。上述结果可为该蛋白酶基因的异源表达和结构与功能关系等方面的研究提供参考。

关键词：总状毛霉丝氨酸蛋白酶基因生物信息学分析