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人D-二聚体分离纯化及鉴定

中国输血杂志 2013年第6期26卷 521-524页

作者：苏娜林方昭李长清马莉肖薇肖小璞中国医学科学院北京协和医学院输血研究所四川成都610052

目的分离纯度较高和人D-二聚体(D-dimer),为制备抗人D-二聚体单克隆抗体提供可靠抗原。方法以凝血酶、凝血因子等处理人纤维蛋白原,得到交联纤维蛋白,经纤溶酶消化,得到交联纤维蛋白降解产物(FDP);对FDP作Sephacryl S-300凝胶过滤层... 详细信息

目的分离纯度较高和人D-二聚体(D-dimer),为制备抗人D-二聚体单克隆抗体提供可靠抗原。方法以凝血酶、凝血因子等处理人纤维蛋白原,得到交联纤维蛋白,经纤溶酶消化,得到交联纤维蛋白降解产物(FDP);对FDP作Sephacryl S-300凝胶过滤层析和聚焦层析,分离纯化得到D-dimer。采用免疫比浊法测定D-dimer含量、染料结合法测定纯化蛋白含量,以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察D-dimer的纯化情况,WestonBlot法确认D-dimer的存在。结果制备得到的FDP SDS-PAGE图谱显示有多条蛋白条带,1条分子量为180～250kD蛋白条带在Western Blot图谱中显示可以被D-dimer单克隆抗体特异性地识别。FDP经Sephacry S-300凝胶层析和聚焦层析后得到纯度较高的D-dimer(n=3):总蛋白含量比为(77.82±7.98)%,蛋白回收率(25.27±6.35)%;SDS-PAGE图谱显示:经过两步层析得到的终产物为分子量180～250 kD的蛋白;Western Blot证实:经过Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析处理,最终得到分子量为180～250 kD的终产物可被D-dimer单克隆抗体特异性识别。结论采用Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析能够分离纯化获得较高纯度的D-dimer,可作为制备D-dimer单克隆抗体的抗原。

关键词： D-二聚体人交联纤维蛋白降解物凝胶层析聚焦层析分离纯化,鉴定

荧光定量PCR法用于转染CHO细胞中人凝血因子Ⅶ基因拷贝数检测的研究

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中国输血杂志 2014年第6期27卷 602-605页

作者：肖薇李长清林方昭中国医学科学院北京协和医学院输血研究所四川成都610052

目的采用荧光定量PCR法检测转染后可分泌表达人凝血因子ⅦCHO细胞株CHO-FⅦ中FⅦ基因的拷贝数。方法提取CHO-FⅦ和CHO-pcDNA3.1(空载体转染得到的细胞株)基因组DNA,分别以含有β-actin基因片段的质粒pMDT-actin和含有FⅦ全长cDNA序列的... 详细信息

目的采用荧光定量PCR法检测转染后可分泌表达人凝血因子ⅦCHO细胞株CHO-FⅦ中FⅦ基因的拷贝数。方法提取CHO-FⅦ和CHO-pcDNA3.1(空载体转染得到的细胞株)基因组DNA,分别以含有β-actin基因片段的质粒pMDT-actin和含有FⅦ全长cDNA序列的质粒pcDNA-FⅦ制作标准曲线,以CHO-FⅦ和CHO-pcDNA3.1的DNA为模板进行qPCR反应,计算出模板中细胞总数以及目的基因的拷贝数,得到每个细胞中目的基因的拷贝数,反应均在ABI Stepone Plus荧光定量PCR仪上进行。结果经检测模板中的细胞数为24 421±7 414,FⅦ基因的拷贝数49 455±3 502,每个细胞含有2个FⅦ基因拷贝,空载体转染得到的细胞株中并没有检测到FⅦ基因的存在。结论 FⅦ基因是以2个拷贝的比例整合到宿主染色体上的。

关键词：人凝血因子Ⅶ 绝对定量实时荧光定量PCR 拷贝数

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蛋白C、蛋白S的研究与应用

中国输血杂志 2010年第4期23卷 322-326页

作者：王宗奎林方昭肖小璞李长清中国医学科学院输血研究所四川成都610081

蛋白C(protein C, PC)抗凝系统是机体内重要的抗凝系统,主要由PC,蛋白S(protein S, PS),蛋白C抑制物(proteinC inhibitor, PCI)和血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)组成[1],在血液凝固和纤溶过程起着重要的平衡作用.PC是PC系统最主要的... 详细信息

蛋白C(protein C, PC)抗凝系统是机体内重要的抗凝系统,主要由PC,蛋白S(protein S, PS),蛋白C抑制物(proteinC inhibitor, PCI)和血栓调节蛋白(thrombomodulin, TM)组成[1],在血液凝固和纤溶过程起着重要的平衡作用.PC是PC系统最主要的组成成分,是体内重要的抗凝因子,其抗凝活性占全血的20%—30%,体外只要达到0.2μg/ml即可引起明显的抗凝效应,直接影响凝血与抗凝血机制的平衡[1, 2],而PC的生理功能又与PS密切相关,故我们综合有关资料对PC抗凝系统中的PC,PS做一介绍

关键词：蛋白C 蛋白S 抗凝系统活化的蛋白C

LD-PCR检测FⅧ基因XbaⅠ位点多态性及其在血友病A携带者诊断中的应用

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中国输血杂志 2013年第1期26卷 33-36页

作者：刁戈马莉林方昭孙盼李长清肖小璞中国医学科学院北京协和医学院输血研究所四川成都610052

目的建立高特异性的针对凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22中XbaⅠ多态性位点的连锁分析法,以用于血友病A家系携带者的诊断。方法采用长距离PCR(LD-PCR)方法,特异性地扩增FⅧ基因内含子22中的XbaⅠ位点所在区域,用限制性内切酶XbaⅠ酶切,对5... 详细信息

目的建立高特异性的针对凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22中XbaⅠ多态性位点的连锁分析法,以用于血友病A家系携带者的诊断。方法采用长距离PCR(LD-PCR)方法,特异性地扩增FⅧ基因内含子22中的XbaⅠ位点所在区域,用限制性内切酶XbaⅠ酶切,对5个血友病A家系作家系连锁分析,并对其中可提供多态性信息的家系作携带者诊断。结果家系1中确诊女性携带者1名及1名正常女性成员;家系2中确诊1名女性携带者;而家系3、家系4和家系5该位点无法提供多态性信息。结论基于LD-PCR的FⅧ基因XbaⅠ位点连锁分析方法具有较高的准确性和可靠性,这对临床上诊断血友病A携带者具有积极的意义。

关键词：血友病A FⅧ基因 LD—PCR 连锁分析携带者诊断

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DNA测序法检测血友病B患者F9基因突变

中国输血杂志 2013年第11期26卷 1084-1087页

作者：马莉刁戈肖小璞孙盼李长清林方昭中国医学科学院北京协和医学院输血研究所四川成都610052

目的分析血友病B患者凝血因子Ⅸ(F9)基因突变情况。方法检测3名非亲缘关系疑似血友病B患者的表型,确定其活性缺失因子;采用PCR结合DNA测序的方法对患者F9基因作序列分析,确定其突变位点。结果 3名患者均表现为FⅨ促凝活性(FⅨ∶C)明显偏... 详细信息

目的分析血友病B患者凝血因子Ⅸ(F9)基因突变情况。方法检测3名非亲缘关系疑似血友病B患者的表型,确定其活性缺失因子;采用PCR结合DNA测序的方法对患者F9基因作序列分析,确定其突变位点。结果 3名患者均表现为FⅨ促凝活性(FⅨ∶C)明显偏低,分别为6.1%、14.7%及6.5%,故诊断为血友病B患者,其F9基因突变分别为G20341A(Gly133Arg)、G30116A(Ala233Thr)及G31095A(Cys336Tyr)。结论检测到3名血友病B患者的F9基因上均发生序列改变,证实了血友病B患者F9基因缺陷的分子机制。

关键词：血友病B 凝血因子IX 内基因基因突变 DNA测序

去冷沉淀血浆中部分凝血因子及总蛋白的质量分析

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中国输血杂志 2013年第6期26卷 550-551页

作者：柏则蓉葛健民梁启忠李长清马莉林方昭盐城市中心血站江苏盐城224005 中国医学科学院北京协和医学院输血研究所

目的调查分析去冷沉淀血浆(CRP)中部分凝血因子及总蛋白的实际含量,为临床输注提供实验依据。方法抽取40份新鲜全血,按照标准操作规程制备新鲜冰冻血浆(FFP)和CRP,同一人份制备的血浆分为FFP组(n=40)和CRP(n=40)留样,检测2组标本的FⅤ∶... 详细信息

目的调查分析去冷沉淀血浆(CRP)中部分凝血因子及总蛋白的实际含量,为临床输注提供实验依据。方法抽取40份新鲜全血,按照标准操作规程制备新鲜冰冻血浆(FFP)和CRP,同一人份制备的血浆分为FFP组(n=40)和CRP(n=40)留样,检测2组标本的FⅤ∶C、FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、Fg和总蛋白含量的变化。结果 CRP组和FFP组的FⅦ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C、Fg、总蛋白含量比较:(88.8±27.1)%vs(93.2±29.7)%、(23.0±17.4)%vs(83.4±25.8)%、(57.3±12.6)%vs(66.9±12.2)%、(157.7±52.5)mg/dL vs(212.6±50.0)mg/dL、(58.5±6.3)g/L vs(67.0±3.5)g/L(均为P0.05)。结论CRP中的大部分凝血因子活性和总蛋白含量均下降,故临床输注不能等同于FFP和普通血浆。

关键词：去冷沉淀血浆凝血因子活性血浆蛋白新鲜冰冻血浆

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从Cohn法组份Ⅳ中分离纯化人血浆蛋白C

中国输血杂志 2010年第5期23卷 355-360页

作者：王宗奎林方昭肖小璞谢亦武李长清中国医学科学院北京协和医学院输血研究所四川成都610081 China Biologic Products Inc.

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和... 详细信息

目的探索建立1种串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化蛋白C的方法 ,降低纯化蛋白C的成本,并实现血浆的综合利用。方法 4℃条件下,将Cohn法组份Ⅳ用PBS缓冲液抽提5h,离心(6500g)40min,上清液依次用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤后,超滤透析;再通过串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析,对蛋白C进行纯化。通过SDS-PAGE鉴定蛋白C的纯度;用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;通过WHO指定的发色底物法和凝固法(一期法)测定蛋白C活性。结果纯化的蛋白C在SDS-PAGE图谱上呈现1条62kD左右的蛋白带;经过离子交换层析,蛋白C的活性回收率为(48.19±9.22)%,纯化倍数为(3.75±0.56)倍;固相化金属螯合亲和层析后,蛋白C活性回收率为(59.61±5.59)%,纯化倍数为(36.79±3.72)倍;蛋白C总活性回收率为(28.77±9.45)%,纯化倍数为(136.64±6.82)倍,比活性为(11.70±0.89)IU/mg。结论串联离子交换层析和固相化金属螯合亲和层析可以从Cohn法组份Ⅳ中获得比活性较高的蛋白C浓缩物。

关键词： Cohn法组份Ⅳ 蛋白C 分离纯化亲和层析,固相化金属螯合比活性

人凝血因子Ⅶ基因在CHO-K1细胞中的瞬时表达与鉴定

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中国输血杂志 2013年第10期26卷 990-993页

作者：肖薇赵睿李长清曹海军刘彬肖小璞林方昭中国医学科学院北京协和医学院输血研究所四川成都610052

目的在CHO-K1细胞中瞬时表达所克隆的人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的cDNA序列并表达其产物。方法首先从HepG2细胞中克隆人FⅦcDNA序列,将克隆得到的序列连接到pMD18-T载体上经测序验证后,将其与pcDNA3.1载体连接,构建得到重组表达质粒pcDNA3.1-F... 详细信息

目的在CHO-K1细胞中瞬时表达所克隆的人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的cDNA序列并表达其产物。方法首先从HepG2细胞中克隆人FⅦcDNA序列,将克隆得到的序列连接到pMD18-T载体上经测序验证后,将其与pcDNA3.1载体连接,构建得到重组表达质粒pcDNA3.1-FⅦ。将构建得到的表达质粒瞬时转染CHO-K1细胞,72 h取样,采用ELISA、Western blotting等方法对细胞上清液和细胞裂解物作鉴定。结果克隆得到的序列经NCBI比对后为FⅦ转录突变体Ⅱ基因序列,克隆得到的基因未见氨基酸突变,重组表达质粒pcDNA3.1-FⅦ经PCR、双酶切、测序验证正确。ELISA法未在上清中检测到目的蛋白,而在细胞裂解液中检测到了目的蛋白;Western blotting检测到表达产物有与FⅦ标准品类似的分子量为50 kD左右的特异性条带。结论在转染后的CHO-K1细胞裂解液上清中成功表达了hFⅦ蛋白。

关键词：人凝血因子VII CHO—K1细胞克隆基因表达

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1例凝血因子Ⅺ缺乏症的基因突变研究

中国输血杂志 2012年第2期25卷 142-144页

作者：刁戈马莉林方昭周敏孙盼李长清肖小璞中国医学科学院北京协和医学院输血研究所四川成都610052 成都市妇女儿童中心医院

目的研究1例凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症患者的基因突变,揭示其分子发病机制。方法应用凝固时间法测定患者血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原含量(Fbg)、凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ∶C)、凝血因子... 详细信息

目的研究1例凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症患者的基因突变,揭示其分子发病机制。方法应用凝固时间法测定患者血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原含量(Fbg)、凝血因子Ⅷ促凝活性(FⅧ∶C)、凝血因子Ⅸ促凝活性(FⅨ∶C)、FⅪ促凝活性(FⅪ∶C)及凝血因子Ⅻ促凝活性(FⅫ∶C);采用聚合酶链式反应(PCR)扩增产物直接测序的方法对患者FⅪ基因进行直接检测,鉴别其中可能存在的基因变异。结果患者血浆中APTT、PT、TT、Fbg含量、FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅪ∶C及FⅫ:C分别为64.2s、12.8s、17.9s、3.8g/L、87.4%、71.2%、16.6%及80.2%,其FⅪ基因第13号外显子编码482位氨基酸的碱基发生杂合性的错义突变TGC→TGG(Cys482Trp)。结论 Cys482Trp的杂合突变可能是导致患者FⅪ缺乏的分子发病机制。

关键词：凝血因子Ⅺ缺乏症基因突变聚合酶链式反应