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GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

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生物工程学报 2004年第6期20卷 953-957页

作者：龚巍陈军杨蕴刘中国科学院上海植物生理生态研究所上海200032

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7 ACA)酰化酶 (3 1 5 11)可有效催化GL 7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成 7 氨基头孢烷酸 (7 ACA)而成为两步酶法生产 7 ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL 7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,... 详细信息

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL 7 ACA)酰化酶 (3 1 5 11)可有效催化GL 7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成 7 氨基头孢烷酸 (7 ACA)而成为两步酶法生产 7 ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL 7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR2 0 4 pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7 5～ 8 5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4 0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过 5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率 ,即比酶活看。

关键词： GL-7ACA酰化酶基因工程菌批式补料发酵

地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶的基因克隆

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生物工程学报 1994年第3期10卷 200-205页

作者：李果龙杨蕴刘焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所上海200032

Southern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌U-32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的PstⅠ片段。该片段经同位素标... 详细信息

Southern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌U-32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的PstⅠ片段。该片段经同位素标记后能与地中海拟无枝菌酸菌U-32染色体上一个相同的PstⅠ片段杂交,位于这一片段上的2.1kb SmaⅠ-EcoR Ⅴ片段只能与以硝酸盐为唯一氮源的总RNA杂交,而不能与相同条件下以铵盐为唯一氮源的总RNA杂交,这些结果表明,所克隆到的5.0kb PstⅠDNA片段含有地中海拟无枝菌酸菌U-32的硝酸还原酶基因。这是好氧细菌硝酸还原酶基因克隆的首次报道。由该酶蛋白分子量推测,其结构基因大小在1.5kb左右,进一步的杂交分析发现在5.0kb的PstⅠ片段中含有完整的NR基因。用20种限制酶对重组质粒pJL1进行了限制酶酶谱的构建,发现有10种酶在pJL1外源片段上无切点,6种酶为单切点,EcoRⅠ与SmaⅠ各有两个切点。

关键词：地中海拟无枝菌酸菌硝酸还原酶

地中海拟无枝菌酸菌U-32的3-氨基5-羟基苯甲酸合成酶(AHBAS)基因的克隆与序列分析

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生物工程学报 1999年第2期15卷 160-165页

作者：黄健强姜卫红赵国屏杨蕴刘焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所微生物次生代谢分子调控开放实验室

地中海拟无枝菌酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）Ｕ３２是一种临床上重要的抗生素———力复霉素ＳＶ的产生菌。研究表明，在地中海拟无枝菌酸菌的力复霉素生物合成过程中，３氨基５羟基苯甲酸合成酶... 详细信息

地中海拟无枝菌酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）Ｕ３２是一种临床上重要的抗生素———力复霉素ＳＶ的产生菌。研究表明，在地中海拟无枝菌酸菌的力复霉素生物合成过程中，３氨基５羟基苯甲酸合成酶（ＡＨＢＡＳ）是合成中间体Ｃ７Ｎ母核（又称ＡＨＢＡ）的关键酶。通过筛选以广宿主粘粒（Ｃｏｓｍｉｄ）ｐＬＡＦＲ３为载体构建的地中海拟无枝菌酸菌Ｕ３２的基因文库，获得６个阳性克隆子。将含有ＡＨＢＡＳ基因的约２５ｋｂ的片段克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ和ＫＳ上，进行酶谱分析得到其在染色体上的初步定位。序列测定表明地中海拟无枝菌酸菌Ｕ３２中的ＡＨＢＡ合成酶基因，由１１６７ｂｐ组成，起始密码子为ＡＴＧ，终止密码子为ＴＧＡ，共编码３８８个氨基酸，所克隆到的ＡＨＢＡ合成酶基因在大肠杆菌的启动子控制下获得诱导表达，蛋白分子量约为４３ｋＤ。

关键词：拟无枝菌酸菌羟基苯甲酸合成酶基因克隆序列

2,4-D对小麦、綠豆幼苗生长和呼吸代謝的影响

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植物生理学报 1965年第5期 1-4页

作者：楊蕴刘薛应龙复旦大学生物系植物生理教研組

引言 2,4-D(2,4-二氯苯酚代乙酸)作为除莠剂的生理机制,过去20年許多作者从不同的角度曾提出过許多作用机制的假說。娄成后等、薛应龙、Woodford, E. K. 等及Hilton, J. L. 等曾加以討論和总結。

关键词：小麦 ppm 呼吸强度麦类作物呼吸速率幼苗

N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶表达可溶性的改造

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N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶表达可溶性的改造

第六届中国酶工程学术研讨会

作者：傅向阳杨蕴刘中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所分子微生物学开放实验室中国科学院上海生命科学研究院工业生物技术研究中心

＜正＞因其自身特性,N-乙酰-D-神经氨酸（N-Acetyl-D-NeuraminicAcid,Neu5Ac）已经成为与重要疾病相关的一些药物研发和生产的中间体。利用N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶（E.C.5.***.3.8）和N-乙酰神经氨酸醛缩酶（E.C.4.***.3.3）两酶在同一...

＜正＞因其自身特性,N-乙酰-D-神经氨酸（N-Acetyl-D-NeuraminicAcid,Neu5Ac）已经成为与重要疾病相关的一些药物研发和生产的中间体。利用N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶（E.C.5.***.3.8）和N-乙酰神经氨酸醛缩酶（E.C.4.***.3.3）两酶在同一反应器中共转化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸可大量制备Neu5Ac。本实验室前期的工作通过从猪肾分离总RNA、反转录、进一步克隆获得N-乙酰-D-葡萄糖胺2一差向异构酶基因,将该基因克隆入pET28b载体于E coli BL21（DE3）表达时目标蛋白质以可溶性形式存在的很少,基本上都以包涵体形式存在于

关键词：

来源： cnki会议评论

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头孢菌素酰化酶基因在大肠杆菌中的表达规律

生物化学与生物物理学报 2002年第4期34卷 526-531页

作者：王恩多郑勇刚李勇姜卫红杨蕴刘中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室

假单孢菌sp .130头孢菌素酰化酶催化戊二酰 7 氨基头孢烷酸的水解反应 ,生成 7 氨基头孢烷酸。 7 氨基头孢烷酸是医药工业合成大多数头孢菌素衍生物的起始原料。在 6种大肠杆菌表达质粒上构建了表达该酶的不同载体 ,得到了不同表达结果... 详细信息

假单孢菌sp .130头孢菌素酰化酶催化戊二酰 7 氨基头孢烷酸的水解反应 ,生成 7 氨基头孢烷酸。 7 氨基头孢烷酸是医药工业合成大多数头孢菌素衍生物的起始原料。在 6种大肠杆菌表达质粒上构建了表达该酶的不同载体 ,得到了不同表达结果的大肠杆菌转化子。这些质粒有各自的特点 ,适用于不同的场合。

关键词： GL7ACA酰化酶重组质粒表达和纯化假单胞菌大肠杆菌

GL-7-ACA酰化酶基因片段的酶谱分析及基因定位

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生物工程学报 1992年第1期8卷 15-22页

作者：杨蕴刘恽定芳彭惠琳焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所

本文报道了从假单胞菌130菌株(Pseudomonas sp.130)染色体上克隆得到的6.8kb的GL-7-ACA酰化酶基因片段的限制酶谱,基因定位以及在不同的大肠杆菌基因启动子控制下酰化酶基因的表达水平。结果表明,所克隆的片段上,不存在EcoR Ⅰ、Hind Ⅱ... 详细信息

本文报道了从假单胞菌130菌株(Pseudomonas sp.130)染色体上克隆得到的6.8kb的GL-7-ACA酰化酶基因片段的限制酶谱,基因定位以及在不同的大肠杆菌基因启动子控制下酰化酶基因的表达水平。结果表明,所克隆的片段上,不存在EcoR Ⅰ、Hind Ⅱ、Cla Ⅰ切点,分别具有一个Hpa Ⅰ、两个Xho Ⅰ、三个BamH Ⅰ以及四个Pst Ⅰ切点,同时初步确定了这些酶切位点之间的相对位置。经过一系列次级克隆研究,GL-7-ACA酰化酶基因已被定位在3.0kb的B_2-B_3-Hpa Ⅰ片段上。实验比较了以pACYC184、pDR540、pUC10等为载体的次级克隆株(分别为pMR9、pMR10和pMR11)在大肠杆菌中酰化酶基因的表达水平,测定数据表明tac启动子的启动活力比tet启动子强,即pMR10的产酶量比pMR9高一倍,而当tac启动子前再串接一个lac启动子时(pMR11),产酶水平并不进一步提高。本文还对假单胞菌基因在大肠杆菌中的表达进行了讨论。

关键词：基因定位基因表达 GL7ACA酰化酶

Burkholderia pickettii中D-乙内酰脲酶基因(dha)的克隆、测序及表达

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生物工程学报 2002年第2期18卷 149-154页

作者：许祯姜卫红焦瑞身杨蕴刘中国科学院上海植物生理生态研究所上海200032

对一株能转化D ,L 对羟基苯乙内酰脲为D 对羟基苯甘氨酸的菌株MMR0 0 3进行了细菌分类学鉴定 ,该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌 (Burkholderiapickettii)。实验通过Southern杂交 ,部分文库构建和筛选 ,并经一系列亚克隆测序分析 ,获得一长度为... 详细信息

对一株能转化D ,L 对羟基苯乙内酰脲为D 对羟基苯甘氨酸的菌株MMR0 0 3进行了细菌分类学鉴定 ,该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌 (Burkholderiapickettii)。实验通过Southern杂交 ,部分文库构建和筛选 ,并经一系列亚克隆测序分析 ,获得一长度为 1374bp的完整开放阅读框 ,编码 45 8个氨基酸的D 乙内酰脲酶基因。用该基因序列构建的高表达质粒pXZPH2转化E .coliBL2 1(DE3) ,经IPTG诱导后 ,检测到D 乙内酰脲酶活性。该基因编码的氨基酸序列经Blast同源比较分析与放射形土壤杆菌NRRLB112 91所产相应酶有 85 %的同源性。以D ,L 对羟基苯乙内酰脲为底物测得的表达酶的活力为 0 6 6u mL ,比相同条件下所测出发菌株MMR0 0 3的酶活提高了

关键词：皮氏伯克霍尔德氏菌 D-乙内酰脲酶基因克隆表达序列分析

提高三角酵母细胞DAO表观活力的透性化研究

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生物工程学报 2001年第1期17卷 73-77页

作者：朱彤波陈军张益棻杨蕴刘焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所上海200032

三角酵母 (Trigonopsisvariabilis)的D 氨基酸氧化酶 (D aminoacidoxidase ,DAO ,EC1 .4.3.3)是一种胞内酶 ,完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力 ,需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。... 详细信息

三角酵母 (Trigonopsisvariabilis)的D 氨基酸氧化酶 (D aminoacidoxidase ,DAO ,EC1 .4.3.3)是一种胞内酶 ,完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力 ,需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。研究中比较了冻融、丙酮、丁醇和十六烷基三甲基溴化铵 (Cetyltrimethylammoniumbro mide ,CTAB)等理化因子的透性化效率 ,并对丙酮的透性化条件进行了优化。证明丙酮的透性化作用与溶剂浓度、保温时间和温度有关。 30 %～ 35 %丙酮浓度 ,4～ 2 8℃保温 ,可得到最大酶活力。透性化所需时间极短 ,在 5min内即可完成。同时 ,透性化细胞中的DAO比无细胞抽提液中的酶对热更为稳定。用丙酮透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化头孢菌素C(CephalosporinC ,CPC)为戊二酰 7ACA(Glutaryl 7 ACA ,GL 7ACA)。

关键词：三角酵母 D-氨基酸氧化酶透性化生物转化表观活力固定化酶