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大肠杆菌抗氟乙酸变株的选育及应用

微生物学报 2000年第1期40卷 100-104页

作者：朱彤波杨蕴刘焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所上海200032

In the cultivation of gene engineered strain of Escherichia coli on glucose medium, excretion and accumulation of acetic acid inhibit not only cell growth but also the the expression of heterologous protein. It is obvious that the desirable host strain maintaining acetate at a low level is one of the approaches to increase the production of recombinant protein. The present article deals with the selection of mutants of *** DP19, DP8, which grow on the medium containing pyruvate as the sole carbon source in the presence of 50mmol/L fluoroacetic acid. It is shown that mutant DP19 is defective in its phosphotransacetylase(PTA)activity and accumulates less acetate in the medium, while DP8 is defective in acetate kinase (ACK)and accumulates similar level of acetate comparing with its parent. Using pta - mutant *** DP19 as host, the expression of GL 7ACA acylase gene on the recombinant plasmid pMR24 is improved, and the yield of enzyme activity in flask fermentation is about twice as much as its parent.

关键词：氟乙酸 GL-7ACA酰化酶抗性菌株选育

N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因的克隆与表达

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浙江大学学报（医学版） 2010年第1期39卷 57-63页

作者：杨蕴刘饶娆沈健冯磊中科院上海植物生理研究所上海200032 浙江医学高等专科学校浙江杭州310053 浙江大学医学院浙江林学院健康管理系浙江杭州310058

目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化***21(DE3),然后将nanA基... 详细信息

目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化***21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌***5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达。结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open read ing frame,ORF)大小为894 bp,编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带。以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化***21(DE3),在得到的转化子***21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导。在N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2%,总回收率为70.6%。全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征。结论:所构建的诱导型产酶菌株***21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株***5α/pRY3都可较多量的产酶。合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征。

关键词： N-乙酰神经氨酸/遗传学果糖-二磷酸醛缩酶大肠杆菌/遗传学聚合酶链反应克隆,分子重组,遗传转染遗传载体基因表达重组蛋白质类

丝裂霉素C抗性基因(mcr)的克隆及其高效表达

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2000年第1期32卷 9-15页

作者：黄健强陆雍涛姜卫红张菁赵国屏杨蕴刘中国科学院上海植物生理研究所!上海200032

头状链轮丝菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｍ）ＡＴＣＣ２７４２２是抗肿瘤药物丝裂霉素Ｃ的主要产生菌。为了研究丝裂霉素Ｃ抗性的分子机制，实验通过鸟枪法克隆技术，从库中筛选获得含有丝... 详细信息

头状链轮丝菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｍ）ＡＴＣＣ２７４２２是抗肿瘤药物丝裂霉素Ｃ的主要产生菌。为了研究丝裂霉素Ｃ抗性的分子机制，实验通过鸟枪法克隆技术，从库中筛选获得含有丝裂霉素Ｃ抗性基因（ｍｃｒ）的６．６ｋｂ外源片段的克隆子，对此外源片段进行一系列亚克隆，将丝裂霉素Ｃ抗性基因定位在３．１ｋｂ的片段中。序列分析的结果表明，此３．１ｋｂ外源片段中存在一长度为１３４７ｂｐ的完整的开放阅读框架（ＯＲＦ），起始密码子为ＡＴＧ，终止密码子为ＴＧＡ，共编码４４８个氨基酸。所克隆到的ｍｃｒ基因能在Ｔ７启动子控制下于大肠杆菌中获得特异性表达，并导致该菌对丝裂霉素Ｃ抗性有了上百倍的提高。在大肠杆菌中高效表达丝裂霉素Ｃ抗性基因所编码的活性蛋白，有助于进一步研究药物抗性的分子机制。

关键词：头状链轮丝菌丝裂霉素C抗性基因克隆高表达抗性水平

GL-7-ACA酰化酶的分离纯化及性质研究

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微生物学报 1997年第3期37卷 196-202页

作者：周宏伟魏中荻杨蕴刘焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所上海200032

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰... 详细信息

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰化酶蛋白,纯化了22倍,得率4.0％,比活力为13.8U/mg。用浓度梯度PAGE测得GL-7-ACA酰化酶的分子量为134kD,用SDS-PAGE测得两个亚基分子量分别为15.5kD和58.4kD。用PI法测得等电点为3.5。GL-7-ACA酰化酶反应最适pH为7.0。反应最适温度为37℃,GL-7-ACA酰化酶对底物GL-7-ACA的K_m值为0.50mmol/L,V_(max)为13.10U·mg^(-1)。Ca^(2+)、EDTA和巯基乙醇对该酶有激活作用,Cu^(2+)、Fe^(2+)和Mg^(2+)等有一定程度的抑制作用。产物7-ACA、戊二酸均为GL-7-ACA酰化酶的反竞争性抑制剂,其K_1值分别为16.58mmol·L^(-1)和9.88mmol·L^(-1)。

关键词：酰化酶 GL-7-ACA酰化酶纯化性质

头状轮生链霉菌中丝裂霉素C抗性基因的克隆及功能研究

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微生物学报 1999年第6期39卷 495-502页

作者：黄健强陆小燕毛应清杨蕴刘焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所微生物次生代谢分子调控开放实验室上海200032

头状轮生链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ２７４２２是抗肿瘤药物丝裂霉素的主要产生菌，实验通过诱变筛选获得不产生丝裂霉素同时对丝裂霉素Ｃ敏感的阻断变种Ｓ６，并以它为... 详细信息

头状轮生链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ２７４２２是抗肿瘤药物丝裂霉素的主要产生菌，实验通过诱变筛选获得不产生丝裂霉素同时对丝裂霉素Ｃ敏感的阻断变种Ｓ６，并以它为受体宿主，以质粒ｐＩＪ６９９为载体，建立野生型头状轮生链霉菌菌株ＡＴＣＣ２７４２２的基因库。采用鸟枪法克隆技术，从库中筛选获得含有丝裂霉素Ｃ抗性基因的６２ｋｂ外源片段的克隆子。将含此外源片段的质粒ｐＬＸ５导入变铅青链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）获得表达。并且首次成功地运用电穿孔法将ｐＬＸ５导入野生型菌株中，使其对丝裂霉素Ｃ的抗性大幅度提高：最低抑制浓度（ＭＩＣ）由原来的２００μｇ／ｍＬ上升至１０００μｇ／ｍＬ以上。摇瓶发酵实验表明：单位菌量的ＡＴＣＣ２７４２２（ｐＬＸ５）的丝裂霉素产量高于野生菌株ＡＴＣＣ２７４２２，因此丝裂霉素Ｃ

关键词：头状轮生链霉菌丝裂霉素C 抗性基因电穿孔

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绿脓杆菌对艮他霉素的耐药机制

中国抗生素杂志 1979年第1期 37-44页

作者：杨蕴刘上海植物生理研究所微生物室

目前耐药绿脓杆茵感染的治疗仍是一个麻烦问题,特别对急性白血病、恶性淋巴肿瘤以及三度烧伤病人来说,常固耐药绿脓杆菌感染而危及生命,有些报导指出绿脓杆菌败血症的死亡率仍较高。在各种抗生素中,对绿脓杆菌比较有效的有下面三种:(1... 详细信息

目前耐药绿脓杆茵感染的治疗仍是一个麻烦问题,特别对急性白血病、恶性淋巴肿瘤以及三度烧伤病人来说,常固耐药绿脓杆菌感染而危及生命,有些报导指出绿脓杆菌败血症的死亡率仍较高。在各种抗生素中,对绿脓杆菌比较有效的有下面三种:(1)多粘菌素类的多粘菌素B(Polymyxin B)和粘杆菌素(Colistin);(2)青霉素类的羧苄青霉素(Carbenicillin)等半合成青霉素以及(3)氨基糖苷类的艮他霉素(Gentamicin)。一般认为理想的药物应具备对人体的毒副反应小而对致病菌有较强毒力的特点,人们把这种相对毒性称为药物的选择作用。

关键词：绿脓杆菌抗生素核糖体青霉素敏感性极毛杆菌属核蛋白体抗菌素耐药菌株磷酸转移酶钝化酶氨基糖碳水化合物

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林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶的酶学性质

微生物学报 1998年第6期38卷 441-448页

作者：金詟杨蕴刘焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所

在分离纯化的基础上,报道了pH、温度和金属离子对林肯链霉菌(Streptomyceslincolnensis)Z-512谷氨酸胺合成酶(GS)活力的影响及GS底物专一性的研究结果.在动力学性质的研究中,发现林肯链霉菌GS在生物合成反应系统中,对底物NH_4CI的饱和... 详细信息

在分离纯化的基础上,报道了pH、温度和金属离子对林肯链霉菌(Streptomyceslincolnensis)Z-512谷氨酸胺合成酶(GS)活力的影响及GS底物专一性的研究结果.在动力学性质的研究中,发现林肯链霉菌GS在生物合成反应系统中,对底物NH_4CI的饱和曲线不遵守米氏方程.Hill作图呈两相曲线.在NH_4CI浓度低的情况下,Hill系数大于1,具有正协同效应;当NH_4CI浓度增加到一定程度时,Hill系数小于1,具有负协同效应.这说明NH_4CI不仅作为林肯链霉菌GS的底物,而且作为一种效应物调节GS的活性.林肯链霉菌GS对底物Glu及ATP的饱和曲线遵守米氏方程.在不同的激活离子存在下,GS对Glu、ATP的Km值也不同.

关键词：林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶酶学性质

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediteranei)U-32硝酸还原酶的定位、纯化及性质

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中国生物化学与分子生物学报 1998年第6期14卷 710-714页

作者：李果龙杨蕴刘焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所

在力复霉素ＳＶ研究中，发现硝酸盐对抗生素合成呈现多效性作用，不仅大幅度提高产量，还对产生菌——地中海拟无枝菌酸菌生理产生多方面的影响，从而提出整体性调节的结论．这一多效性作用是由硝酸盐所引起的，为此对硝酸还原酶进行了... 详细信息

在力复霉素ＳＶ研究中，发现硝酸盐对抗生素合成呈现多效性作用，不仅大幅度提高产量，还对产生菌——地中海拟无枝菌酸菌生理产生多方面的影响，从而提出整体性调节的结论．这一多效性作用是由硝酸盐所引起的，为此对硝酸还原酶进行了研究．首先，通过原生质体渗透裂解发现地中海拟无枝菌酸菌Ｕ－３２的硝酸还原酶是一个胞质酶．该酶极不稳定，缓冲液中加入硝酸钾、甘油等保护剂能极大地提高其稳定性．通过硫酸鱼精蛋白沉淀，硫酸铵分级分离，Ｐｈｅｎｙｌ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ、Ｂｉｏ－ＧｅｌＡ１．５ｍＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析等多步纯化得到了电泳纯的硝酸还原酶．该酶为一７９ｋＤ的单亚基酶，每分子酶含有约２．２９原子的钼，但并不含有非血红素铁、酸不稳定硫、ＦＭＮ及ＦＡＤ，其等电点为６．２，反应最适ｐＨ为７．２，最适温度为４０℃．对硝酸根的Ｋｍ值为１３．３μｍｏｌ／Ｌ．同时分析了该酶的吸收光谱．

关键词：硝酸还原酶定位纯化 A.mediterranei

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微重力和宇宙射线对某些微生物的影响

植物生理学报（0257-4829) 1989年第4期15卷 397-402页

作者：顾薇玲彭惠林杨蕴刘焦瑞身中国科学院上海植物生理研究所上海200032

随着科学的发展,人造卫星的发射成功,人类开始迈向空间,为揭示太空的真实情况,国内、外学者已进行了大量的探索工作(鲁子贤 1988)。我们利用我国发射的人造卫星进行了搭载试验。

关键词：宇宙生物学微重力宇宙辐射