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应用随机PCR技术制备靶基因文库随机片段

第三军医大学学报 2004年第20期26卷 1878-1880页

作者：吕永强杜桂鑫童贻刚军事医学科学院微生物流行病研究所二室北京100071

目的　用随机PCR技术制备构建靶基因文库的随机基因片段。方法　先扩出靶基因 (HIV1Envgp160 )片段 ,然后设计两条引物 ,1条为锚定随机引物用于扩出靶基因的随机片段 ,另 1条为锚定特异引物用于对随机片段进行扩增 ,得到大量的随机片段 ... 详细信息

目的　用随机PCR技术制备构建靶基因文库的随机基因片段。方法　先扩出靶基因 (HIV1Envgp160 )片段 ,然后设计两条引物 ,1条为锚定随机引物用于扩出靶基因的随机片段 ,另 1条为锚定特异引物用于对随机片段进行扩增 ,得到大量的随机片段 ;优化模板量、dNTP浓度、反应时间、温度和DNA聚合酶等反应条件 ,扩出靶基因的随机片段。结果　得到用于建库的理想靶基因随机片段。结论　随机PCR是制备靶基因文库随机片段的一个简便有效方法。

关键词：靶基因随机PCR 文库 HIV 扩增制备基因片段 dNTP浓度 DNA聚合酶随机引物

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及转染骨髓间充质干细胞的研究

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中华实验外科杂志 2003年第5期20卷 436-438页

作者：孙大铭侯树勋杜桂鑫童贻刚付小兵解放军304医院骨科全军骨科研究所北京100037 军事医学科学院微生物及流行病研究所

目的　构建骨形成蛋白 (BMP) 7重组腺病毒 ,使其转染骨髓间充质干细胞并在细胞内得到表达。方法　将BMP7基因克隆到转移载体 pAdTrack CMV中 ,在细菌BJ5 183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组 ,得到BMP7重组腺病毒基因组 ,通过转染HE... 详细信息

目的　构建骨形成蛋白 (BMP) 7重组腺病毒 ,使其转染骨髓间充质干细胞并在细胞内得到表达。方法　将BMP7基因克隆到转移载体 pAdTrack CMV中 ,在细菌BJ5 183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组 ,得到BMP7重组腺病毒基因组 ,通过转染HEK2 93细胞包装出重组腺病毒。利用BMP7重组腺病毒转染分离纯化后的骨髓间充质干细胞 ,鉴定BMP7在细胞内的表达。结果　经过多聚酶链反应 (PCR)及酶切鉴定证明获得了BMP7转移质粒pAdTrack BMP7和BMP7重组腺病毒基因组 ,并包装出重组腺病毒。逆转录PCR和免疫组织化学证明BMP7在重组腺病毒转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。结论　BMP7重组腺病毒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达 ,为BMP7基因治疗的研究奠定了基础。

关键词：骨形成蛋白7 腺病毒构建转染骨髓问充质干细胞

TGF-β_1成熟肽基因克隆及在大肠杆菌中表达

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解放军医学杂志 2002年第5期27卷 434-436页

作者：孙大铭侯树勋杜桂鑫童贻刚付小兵解放军第304医院军事医学科学院微生物研究所

为在原核细胞中表达TGF β1单体蛋白 ,用基因重组技术构建pBV2 2 0 TGF β和 pQE TGF β两种原核表达载体 ,分别在M15和DH5α大肠杆菌中进行表达 ,然后利用SephacrylS 10 0凝胶层析及Ni+ NTA琼脂柱纯化TGF β1单体。经酶切鉴定及测序... 详细信息

为在原核细胞中表达TGF β1单体蛋白 ,用基因重组技术构建pBV2 2 0 TGF β和 pQE TGF β两种原核表达载体 ,分别在M15和DH5α大肠杆菌中进行表达 ,然后利用SephacrylS 10 0凝胶层析及Ni+ NTA琼脂柱纯化TGF β1单体。经酶切鉴定及测序结果证明pBV2 2 0和pQE30载体上成功地插入了TGF β1成熟肽基因片段。pBV2 2 0 TGF β和pQE TGF β两种原核表达载体在大肠杆菌中均得到了高效表达 ,表达量约占全菌蛋白的 15 %和 2 0 % ,表达的TGF β1单体蛋白经纯化后进行SDS PAGE电泳 ,均显示了一条蛋白带 ,分子量分别为 13kD和 15kD左右。

关键词：转化生长因子β 基因重排基因表达质粒大肠杆菌

骨形成蛋白7真核表达质粒的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达

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中华外科杂志 2003年第6期41卷 445-448页

作者：侯树勋孙大铭杜桂鑫童贻刚付小兵解放军第三○四医院骨科北京100037 军事医学科学院微生物及流行病研究所

目的　构建骨形成蛋白 7(hBMP7)基因真核表达质粒 ,并使其在骨髓间充质干细胞中表达。　方法　采用PCR技术扩增BMP7基因 ,将其插入真核表达载体pcDNA3 1中 ,利用梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞 (MSCs) ,然后用构建的BMP7表达质粒转... 详细信息

目的　构建骨形成蛋白 7(hBMP7)基因真核表达质粒 ,并使其在骨髓间充质干细胞中表达。　方法　采用PCR技术扩增BMP7基因 ,将其插入真核表达载体pcDNA3 1中 ,利用梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞 (MSCs) ,然后用构建的BMP7表达质粒转染MSCs,使其得到表达。结果　经过PCR及酶切鉴定证明获得了BMP7真核表达质粒pcDNA BMP7,通过反转录PCR和免疫组化鉴定证明BMP7在转染后的骨髓间充质干细胞中得到了表达。　结论　BMP7真核表达质粒的构建和在骨髓间充质干细胞中的表达 ,为BMP7基因治疗的研究奠定了坚实的基础 ,同时也为组织工程成骨和成软骨的研究提供了改良的种子细胞。

关键词：骨形成蛋白7 真核表达质粒构建骨髓间充质干细胞基因转染

丙型肝炎病毒NS5ab区的B细胞模拟表位的确认

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免疫学杂志 2003年第4期19卷 265-268,273页

作者：侯利华杜桂鑫王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所分子生物学研究室北京100071

目的　用噬菌体展示随机肽库研究丙型肝炎病毒 (HCV)NS5ab区的B细胞表位。方法　在原核系统中表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,亲和层析纯化血清中抗HCVNS5ab的特异多抗 ,用此多抗来筛选噬菌体递呈随机 12肽库 ,获得HCVNS5ab区的B细胞表位。结... 详细信息

目的　用噬菌体展示随机肽库研究丙型肝炎病毒 (HCV)NS5ab区的B细胞表位。方法　在原核系统中表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,亲和层析纯化血清中抗HCVNS5ab的特异多抗 ,用此多抗来筛选噬菌体递呈随机 12肽库 ,获得HCVNS5ab区的B细胞表位。结果　成功地表达了HCVNS5ab重组蛋白 ,用此蛋白检验了 130份HCV阳性血清 ,阳性率为 36 %。在筛选的噬菌体展示随机肽库后 ,挑取 13个阳性克隆测序 ,有 9个序列不同 ,最终通过噬菌体表位表达的方法确认了 3个表位。

关键词：丙型肝炎病毒 NS5ab区 B细胞模拟表位噬菌体展示随机肽库

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶结构域在昆虫细胞中的表达及鉴定

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中华传染病杂志 2002年第1期20卷 10-13页

作者：杜桂鑫侯利华王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所应用分子生物学实验室北京100071

目的　利用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶结构域 (proteasedomain)的重组蛋白。方法　构建含有HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因的杆状病毒转移载体 pFBCNS3N ,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座 ,提取重组Bacmid... 详细信息

目的　利用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶结构域 (proteasedomain)的重组蛋白。方法　构建含有HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因的杆状病毒转移载体 pFBCNS3N ,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座 ,提取重组Bacmid用Lipofectamine法转染昆虫细胞Sf9包装成重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行蛋白表达 ,用SDS PAGE电泳和免疫印迹实验分析表达情况 ;利用去垢剂十二烷基肌酸钠溶解重组蛋白后以Ni NTAagrose柱亲和纯化重组蛋白 ;以重组蛋白NS5ab(包含NS5A羟基端部分和NS5B氨基端部分的重组蛋白 )为底物检测丝氨酸蛋白酶的酶切活性 ;以间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性。结果　HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因在昆虫细胞中获得高水平表达 ;重组蛋白能够部分溶解于含有去垢剂十二烷基肌酸钠的缓冲液 ;从 5× 10 7细胞中总共获得 0 .2mg重组蛋白 ,纯度大于 90 %;重组丝氨酸蛋白酶能够将NS5ab切割成两个片段 ;血清学实验证实该蛋白抗原性很好。结论　昆虫细胞表达的HCV丝氨酸蛋白酶结构域为膜结合型蛋白 ,具有良好的酶学活性以及抗原性。

关键词：丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶昆虫细胞去垢剂

丙型肝炎病毒核心蛋白在昆虫细胞中表达、加工和细胞定位研究

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病毒学报 2002年第3期18卷 198-204页

作者：杜桂鑫侯利华童贻刚王海涛军事医学科学院微生物流行病研究所应用分子生物学实验室北京100071

以杆状病毒 -昆虫细胞表达系统Bac-to -Bac为模型 ,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨。根据核心蛋白的亲水性分析结果 ,设计了三种长度的基因片段 (C173 、C191和C2 15) ,经过PCR扩增、重组转移载体构建、... 详细信息

以杆状病毒 -昆虫细胞表达系统Bac-to -Bac为模型 ,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨。根据核心蛋白的亲水性分析结果 ,设计了三种长度的基因片段 (C173 、C191和C2 15) ,经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染 ,获得三种重组病毒 (rvBACC173 、rvBACC191和rvBACC2 15)用于表达分析。SDS -PAGE电泳和免疫印迹试验表明 ,昆虫细胞能够识别核心蛋白第 191和 192位氨基酸之间的切点并低效率切割 ;但不能够识别 173～ 191位之间的切点。间接免疫荧光试验表明 ,截断型核心蛋白C173 定位于细胞核内 ,而C191和C2 15则停留在细胞浆中。rvBACC173 感染的细胞在核内出现单一的“类晶体样结构” ,电子显微镜分析证实 ,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体。试验结果还表明 ,第 173至 191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达 ,并且影响蛋白在细胞内的分布。间接ELISA实验证实。

关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白昆虫细胞表达加工细胞定位研究

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表位水平研究病毒流行病学的方法探讨

微生物学报 2002年第3期42卷 331-334页

作者：来大志杜勇杜桂鑫陈薇王海涛北京微生物流行病研究所北京100071

应用噬菌体随机展示肽库和硫氧还蛋白表面展示技术 ,建立了在表位水平研究病毒流行病学的方法 ,并以丙型肝炎病毒核心区蛋白做了初步验证。

关键词：表位流行病学肽库噬菌体硫氧还蛋白表面展示 HCV

人PBM C中IL-18基因的克隆及在***中的高效表达与纯化

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免疫学杂志 1999年第4期15卷 226-228页

作者：杜勇汪涛杜桂鑫徐静侯利华王海涛军事医学科学院微生物流行病学研究所北京100071

从一名丙型肝炎病人的外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中分别克隆了前体和成熟人白细胞介素－１８（ｈＩＬ－１８）的基因，并应用大肠杆菌表达系统（ｐＱＥ－３０），成功地表达了重组ｈＩＬ－１８的前体和成熟蛋白。从人ＰＢＭＣ中提取... 详细信息

从一名丙型肝炎病人的外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中分别克隆了前体和成熟人白细胞介素－１８（ｈＩＬ－１８）的基因，并应用大肠杆菌表达系统（ｐＱＥ－３０），成功地表达了重组ｈＩＬ－１８的前体和成熟蛋白。从人ＰＢＭＣ中提取总ＲＮＡ，用ｐｏｌｙ（Ｔ）８－１２反转录成ｃＤＮＡ，再以ＰＣＲ扩增出特异ＤＮＡ片段。利用Ｅ．ｃｏｌｉ表达载体ｐＱＥ－３０，构建分别表达ｈＩＬ－１８前体和成熟蛋白的的重组质粒ｐＱＥＩＬ１８ｐ和ｐＱＥＩＬ１８ｍ，转化Ｅ．ｃｏｌｉＭ１５后，经ＩＰＴＧ诱导，表达出相对分子质量分别为２４ＫＤ和１９ＫＤ的重组蛋白，表达量占菌体蛋白的３０％和３５％。序列测定证实，ｈＩＬ－１８前体蛋白基因长５８２ｂｐ，成熟蛋白基因长４７７ｂｐ。经金属螯合层析纯化，获得了高纯度的表达蛋白。生物学活性鉴定，重组成熟蛋白能显著刺激Ｃｏｎ

关键词： PBMC 重组表达纯化单核细胞白细胞介素18