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磷酸化、乙酰化修饰对p53功能的影响

中华病理学杂志 2002年第6期31卷 551-553页

作者：李瑶琛孔令洪王一理司履生西安交通大学生命学院免疫病理研究室 710061

在人类基因组解码之后，将是对基因所编码蛋白质的研究。收白质在成熟的过程中乃至成熟之后需要经过一毓的修饰如甲基化、磷酸化、乙酰化、糖基化等使蛋白质的构象发生一定的变化，方可执行特定的功能。如组蛋白的乙酰化、一些转录因子... 详细信息

在人类基因组解码之后，将是对基因所编码蛋白质的研究。收白质在成熟的过程中乃至成熟之后需要经过一毓的修饰如甲基化、磷酸化、乙酰化、糖基化等使蛋白质的构象发生一定的变化，方可执行特定的功能。如组蛋白的乙酰化、一些转录因子的磷酸化或乙酰化等~[1]。因此，仅仅从基因的角度来研究并预测蛋白质的功能是远远不够的p53是参与细胞周期调节、控制细胞增生、凋亡的一个中枢性调节分子，一直深受细胞生物学家和肿瘤生物学家的关注。以往的大量研究表明人类肿瘤半数以上存在p53基因突变，认为p53基因突变失活是导致这些细胞癌变的根本所在。但是实验发现，尚有众多人类肿瘤中没有p53基因突变，却有p53功能性灭活。研究还发现：转录因子p53同其他蛋白质一样，翻译后有极为丰富的加工与修饰，p53的这种修饰是调节p53活性与稳定性的重要机制~[2]。可见，翻译后修饰对p53功能至关重要，更可能与某些肿瘤的发生密切相关。因此，对p53翻译后修饰与功能的关系作一综述。

关键词：磷酸化乙酰化修饰 p53 功能结核活化

重组人TNF-α诱导乳腺癌细胞ZR75-1凋亡及其机制的初步研究

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癌症 2006年第5期25卷 560-565页

作者：李瑶琛孔令洪李康生汕头大学医学院微生物学与免疫学研究室广东汕头515031 西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所陕西西安710061

背景与目的:肿瘤坏死因子α(TNF-α)是抗肿瘤活性较强的细胞因子,是重要的抗肿瘤生物治疗制剂之一,但由于其对人体有较严重的副作用,临床应用受到了限制。为了降低其毒副作用,同时保留其抗肿瘤能力,TNF-α的突变体——突变型471TNF-α... 详细信息

背景与目的:肿瘤坏死因子α(TNF-α)是抗肿瘤活性较强的细胞因子,是重要的抗肿瘤生物治疗制剂之一,但由于其对人体有较严重的副作用,临床应用受到了限制。为了降低其毒副作用,同时保留其抗肿瘤能力,TNF-α的突变体——突变型471TNF-α应运而生。本研究对重组人突变型471rhTNF-α与野生型rhTNF-α蛋白的抗肿瘤能力进行了比较,并对突变型471rhTNF-α诱导ZR75-1细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究。方法:以乳腺癌细胞系ZR75-1为靶细胞,以基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析100"g/L突变体471rhTNF-α与100"g/L野生型rhTNF-α作用ZR75-1细胞12h,肿瘤细胞发生凋亡的情况;利用以ELISA为基础的TransAMTMNF-κBp65试剂盒检测10μg/L、50μg/L和100μg/L突变体471rhTNF-α或野生型rhTNF-α作用ZR75-1细胞4h后核因子NF-κB的活化情况。结果:2%琼脂糖凝胶电泳显示,突变体471rhTNF-α处理组的ZR75-1细胞基因组DNA呈现明显的“ladder”状分布,野生型rhTNF-α处理组的“ladder”条带明显减弱;流式细胞仪分析显示,突变型471rhTNF-α诱导的凋亡峰面积为(44.6±3.6)%,野生型rhTNF-α诱导凋亡峰面积占(24.7±2.7)%,两组差异具有显著性(P0.05)。NF-κB活化检测结果显示,50"g/L野生型rhTNF-α处理ZR75-1细胞4h后NF-κB的活化量(A值为3.27±0.1)明显高于突变型471rhTNF-α处理组(A值为1.51±0.2)。结论:突变型471rhTNF-α比野生型rhTNF-α具有更强的诱导ZR75-1细胞凋亡的能力;ZR75-1细胞内NF-κB活化明显受限是突变型471rhTNF-α诱导凋亡能力增强的主要原因之一。

关键词：乳腺肿瘤 ZR75-1细胞突变型471rhTNF-α 核因子N-αB 凋亡生物治疗

嗅鞘细胞移植后通过分泌MMP-3在RCS-P^+大鼠视网膜中迁移

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第三军医大学学报 2012年第9期34卷 843-847页

作者：谢晶李瑶琛阴正勤第三军医大学西南医院全军眼科中心重庆400038

目的初步研究将嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)及嗅球成纤维细胞(olfactory nerve fibroblasts,ONF)混合细胞移植到皇家外科学院大鼠(Royal College of Surgeon rat,RCS-P+rat)的视网膜下腔后,OECs/ONF迁移进入视网膜的机制。方法离体实验中,取成年RCS-rdy+-P+大鼠的嗅球培养OECs/ONF至14 d行OECs/ONF的基质金属蛋白酶-3(matrix-metalloproteinase-3,MMP-3)细胞免疫荧光染色。收集5、8、11、14 d OECs/ONF培养液上清,与普通培养液超滤后进行酶联免疫吸附实验(ELISA),检测MMP-3的含量变化。在体实验中,制作40只RCS-P+大鼠单眼视网膜下腔细胞移植,并以对侧眼作为伪手术组以及相同天龄未处理大鼠作为对照组。术后7、14、21、28 d用ELISA法检测细胞移植组、伪手术组及未处理组大鼠视网膜中MMP-3含量的变化。将携带绿色荧光的慢病毒感染后的OECs/ONF移植到4只RCS-P+大鼠视网膜下腔,激光共聚焦显微镜观察移植后7、14、21 d及28 d OECs/ONF在视网膜中迁移情况。结果离体实验中,培养14 d时OECs/ONF的MMP-3免疫细胞化学染色阳性。OECs/ONF培养液上清MMP-3含量分别为5 d(2.83±0.80)、8 d(6.34±1.12)、11 d(11.65±1.35)、14 d(19.11±2.11),明显高于普通D/F12+10%FBS培养液(1.65±0.44)(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察可见移植后7～28 d,OECs/ONF在视网膜中迁移,最远能够达到神经节细胞层。结论 OECs/ONF移植到RCS视网膜下腔后,可能通过分泌MMP-3在RCS-P+大鼠视网膜中迁移。

关键词：嗅鞘细胞皇家外科学院大鼠视网膜移植迁移基质金属蛋白酶-3

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人ECK基因外显子3的实验研究

西安交通大学学报（医学版） 2003年第5期24卷 423-426页

作者：孔令洪李瑶琛王一理司履生西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所陕西西安710061

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR... 详细信息

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增eck基因exon 3片段 ,克隆入中介载体pUCm T中构建重组质粒 ,转化JM10 9大肠杆菌 ,扩增后经酶切、PCR初步鉴定后 ,进行序列分析。结果　①从正常皮肤组织上皮细胞、ZR 75 1细胞系基因组DNA中 ,经PCR扩增 ,获得了人eck基因exon 3片段 ;②建立了正常皮肤组织、ZR 75 1细胞系eck基因exon 3片段的克隆 ;③ZR 75 1细胞系中eck基因exon 3片段存在突变。结论　从人组织与细胞系基因组DNA中 ,成功地构建了人类eck基因exon 3的克隆 ,并证实eck基因exon 3在ZR 75 1乳腺癌细胞系中有突变 ,为进一步研究eck基因exon

关键词：人ECK基因外显子3 基因克隆聚合酶链反应基因测序

人重组TNF-α突变体471蛋白的初步纯化及生物学活性

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细胞与分子免疫学杂志 2003年第4期19卷 409-412页

作者：李瑶琛孔令洪王一理尚宁宽耿宜萍司履生西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所陕西西安710061

目的 :在利用原核表达系统表达重组人突变体 4 71TNF α蛋白的基础上 ,对该蛋白进行初步纯化及生物学活性检测。方法 :利用最佳发酵和表达条件 ,诱导基因重组的人突变体4 71TNF α工程菌表达目的蛋白。收集菌体 ,经超声破碎 ,分离人突变... 详细信息

目的 :在利用原核表达系统表达重组人突变体 4 71TNF α蛋白的基础上 ,对该蛋白进行初步纯化及生物学活性检测。方法 :利用最佳发酵和表达条件 ,诱导基因重组的人突变体4 71TNF α工程菌表达目的蛋白。收集菌体 ,经超声破碎 ,分离人突变体 4 71TNF α的包涵体 ,并观察变性剂及蛋白浓度对蛋白折叠的影响。采用MTT比色法检测并比较人野生型及突变体 4 71TNF α的生物学活性。结果 :在适当的变性与复性条件下 ,已成功地将突变体 4 71TNF α折叠并聚合形成具有生物学活性的三聚体。突变体 4 71TNF α对L92 9的细胞毒活性高于野生型TNF α的 15倍。结论 :原核表达系统中表达的人突变体 4 71TNF α经复性处理后具有显著的生物学活性。

关键词：人突变体471 TNF—α 蛋白纯化 MTT比色法生物学活性

视网膜变性对RCS-P^+大鼠γ-氨基丁酸及其合成酶谷氨酸脱羧酶65表达的影响

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第三军医大学学报 2013年第5期35卷 390-393页

作者：何建荣陈丽峰李瑶琛第三军医大学西南医院全军眼科中心重庆400038

目的观察视网膜变性过程中γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)及合成酶谷氨酸脱羧酶65(glutamicacid decarboxylase 65,GAD65)的表达变化。方法选择出生后15、30、60、90 d的RCS-P+和同年龄的RCS-rdy+-P+大鼠,采用免疫荧光(IF)和免疫印迹法(Western blot)观察两种大鼠出生后15、30、60、90 d GABA和GAD65的表达差异。结果视网膜中GABA和GAD65主要表达于内核层、内从状层和节细胞层。随着天龄的增加,RCS-rdy+-P+大鼠中GABA阳性细胞逐渐减少。RCS-P+变性鼠在出生后15～60 d GABA阳性细胞随天龄增加逐渐减少,在出生后60～90 d(即视网膜变性中晚期)GABA阳性细胞大量增加,GABA表达明显高于RCS-rdy+-P+大鼠(P<0.05)。不同年龄RCS-rdy+-P+大鼠其GAD65表达恒定,发育对GAD65表达无明显影响;与同年龄RCS-rdy+-P+大鼠相比,30 d RCS-P+大鼠GAD65表达略有增加(P<0.05),90 d时大量增加(P<0.01),其表达随病变发展明显升高。结论在视网膜色素变性过程中,GABA、GAD65在视网膜内层的表达均有显著的升高,提示输入剥夺后GABA能无长突细胞未见损伤,其活性甚至略有增高。

关键词：视网膜变性 γ-氨基丁酸 GAD65

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细胞周期素E与甲状腺肿瘤的关系

西安交通大学学报（医学版） 2002年第5期23卷 438-440页

作者：李瑶琛孔令洪王一理李士瑛司履生西安交通大学生命科学与技术学院免疫病理研究室西安710061 山西医科大学病理解剖学教研室太原030001

目的　检测甲状腺肿瘤组织中CyclinE和PCNA的表达 ,探讨CyclinE与肿瘤发生及恶性程度的关系。方法　利用免疫组织化学技术分析 17例甲状腺腺瘤、43例甲状腺癌及 19例瘤旁“正常”组织中的CyclinE及PCNA的表达。结果　CyclinE及PCNA在“... 详细信息

目的　检测甲状腺肿瘤组织中CyclinE和PCNA的表达 ,探讨CyclinE与肿瘤发生及恶性程度的关系。方法　利用免疫组织化学技术分析 17例甲状腺腺瘤、43例甲状腺癌及 19例瘤旁“正常”组织中的CyclinE及PCNA的表达。结果　CyclinE及PCNA在“正常”组织与甲状腺腺瘤组织中表达无显著性差异 ;CyclinE及PCNA在甲状腺癌中的表达显著高于“正常”组织和甲状腺腺瘤组织 ,且随肿瘤恶性程度的增加而增加 ;CyclinE和PCNA的表达在“正常”组织、甲状腺腺瘤和甲状腺癌组织中均呈正相关。结论　CyclinE的表达可以作为诊断甲状腺癌及预测肿瘤恶性程度的指标。

关键词：细胞周期素E 甲状腺肿瘤增殖细胞核抗原免疫组化

突变型人肿瘤坏死因子-α工程菌发酵培养的实验研究

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西安交通大学学报（医学版） 2003年第3期24卷 211-214页

作者：孔令洪李瑶琛王一理尚宁宽耿宜萍司履生西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所陕西西安710061

目的　优化基因重组人突变型 4 71肿瘤坏死因子 α(TNF α)工程菌的发酵和表达条件。方法　通过改变培养基的组分、pH值、培养温度和诱导表达的条件等 ,采用测定细菌生物量和蛋白表达量等方法 ,确定最适的发酵和表达条件 ,并考察工程菌... 详细信息

目的　优化基因重组人突变型 4 71肿瘤坏死因子 α(TNF α)工程菌的发酵和表达条件。方法　通过改变培养基的组分、pH值、培养温度和诱导表达的条件等 ,采用测定细菌生物量和蛋白表达量等方法 ,确定最适的发酵和表达条件 ,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果　突变型 4 71rhTNF α工程菌在 pH值 7.5的SOC培养基中 ,30℃培养、4 2℃诱导 5h时 ,其表达量最大。而且 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,目的蛋白的表达不受影响。结论　优化了基因重组人突变型 4 71rhTNF α工程菌的发酵和表达的最适条件 ,为进一步开发人突变型 4 71rhTNF

关键词：突变型人肿瘤坏死因子-α 工程菌发酵培养实验重组质粒遗传稳定性肿瘤细胞

重组人突变型471TNF-α及野生型TNF-α的表达及活性初步鉴定

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西安交通大学学报（医学版） 2003年第1期24卷 14-16,29页

作者：李瑶琛孔令洪王一理尚宁宽耿宜萍司履生西安交通大学生命科学与技术学院免疫病理研究室西安710061

目的　采用原核表达系统 ,表达人突变型 471TNF α蛋白 ,并检测其生物学活性。方法　采用PCR技术扩增突变型 471TNF α及野生型TNF αcDNA片段 ,克隆入中间载体pUCm T中 ,并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段 ,克隆入pBV2 2 0中 ,... 详细信息

目的　采用原核表达系统 ,表达人突变型 471TNF α蛋白 ,并检测其生物学活性。方法　采用PCR技术扩增突变型 471TNF α及野生型TNF αcDNA片段 ,克隆入中间载体pUCm T中 ,并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段 ,克隆入pBV2 2 0中 ,转入大肠杆菌DH5α ,温度诱导表达野生型及突变型 471TNF α蛋白。初步纯化蛋白后 ,采用MTT法评估两者对L92 9细胞的杀伤作用。结果　①获得了测序正确的野生型TNF α及突变型 471TNF α的cDNA克隆 ;②构建了正常人野生型TNF α及突变型 471TNF α重组表达质粒 ;③经温度诱导 ,TNF α及突变型 471TNF α蛋白均获得了表达 ;④初步的生物学活性研究表明 ,突变型 471TNF α蛋白的杀伤作用显著高于野生型。结论　突变型 471TNF α的生物学活性优于野生型TNF α ,为进一步开展TNF

关键词： TNF-α 突变体蛋白表达