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基于等温扩增的生物传感器超灵敏检测胞苷脱氨酶和长链非编码RNA

基于等温扩增的生物传感器超灵敏检测胞苷脱氨酶和长链非编码RNA

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作者：李海娟山东师范大学

学位级别：硕士

生物标志物是一种能够标记生命体内各种微观结构和功能变化的生化指标。这些指标可以是核酸、蛋白质、酶、小分子乃至整个细胞,并且通常在生物体内含量极低,因此,亟待开发精准、灵敏的检测方法。创新且高效的基于等温扩增的生物传感器,... 详细信息

生物标志物是一种能够标记生命体内各种微观结构和功能变化的生化指标。这些指标可以是核酸、蛋白质、酶、小分子乃至整个细胞,并且通常在生物体内含量极低,因此,亟待开发精准、灵敏的检测方法。创新且高效的基于等温扩增的生物传感器,已成为生物标志物检测领域的重要工具,其优势在于能够实现快速、高灵敏以及高效的信号扩增。在此,我们开发了两种基于等温扩增的生物传感器,实现对载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽3A(Apolipoprotein B m RNA-editing enzyme catalytic polypeptide like 3A,APOBEC3A)和长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因15(Long noncoding RNA Small Nucleolar RNA Host Gene 15,lncRNA SNHG15)的灵敏检测。(1)本论文构建了一种脱氨触发的等温指数信号扩增的化学发光生物传感器,用于灵敏且无标记地检测APOBEC3A活性。APOBEC3A的存在可催化底物探针脱氨,有效激活引物介导的滚环扩增(Primer generation-mediated rolling circle amplification,PG-RCA)反应,产生大量具有辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)模拟活性的DNAzyme链,用于催化增强的化学发光信号。基于PG-RCA诱导的指数信号扩增和DNAzyme催化提高化学发光,该生物传感器可以灵敏地检测APOBEC3A,且无需任何抗体、标记、苛刻的实验条件、热循环或分离步骤,也可以在单细胞水平上测量内源性APOBEC3A。(2)长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lncRNAs)是各种细胞过程中的关键调控因子,它们的失调与癌变有关。本论文构建了一种高保真的CRISPR/Cas13a反式切割驱动的单量子点(Quantum dot,QD)纳米传感器,用于超灵敏检测临床组织中的lncRNAs。当靶标lncRNA存在时,它能够激活Cas13a/cr RNA来裂解底物探针,产生T7启动子片段,从而启动随后的转录扩增,引发高效的荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),从而对临床组织中的lncRNAs进行检测。利用CRISPR/Cas13a系统优越的特异性、高效的等温转录扩增和基于单量子点的FRET近零的背景的特点,该纳米传感器的检测限低至1.65 a M,且能够以单碱基分辨率区分靶标lncRNA及其不匹配的成员。此外,它还能在单细胞水平上定量lncRNAs,并区分乳腺癌患者组织与健康供体组织之间的lncRNA水平。更重要的是,由于cr RNA(CRISPR-derived RNA)的可编程性,该纳米传感器能够扩展用于检测其他核酸,在与lncRNAs相关的分子诊断方面具有巨大潜力。

关键词： APOBEC3A 长链非编码RNA 等温扩增生物传感器分子诊断

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