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牡蛎疱疹病毒结构蛋白真核表达系统构建及多聚化特性

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水产学报 2024年第5期48卷 65-74页

作者：曹书华魏茂乐李永仁黄博闻辛鲁生白昌明王崇明天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物育种与可持续产出全国重点实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡，成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t)，构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统，... 详细信息

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在全球范围内导致牡蛎、扇贝与蚶类的大规模死亡，成为双壳贝类养殖产业的重要威胁。为了解OsHV-1的结构与致病机制。本研究利用人胚胎肾细胞(HEK293t)，构建OsHV-1主要核衣壳蛋白(ORF104和ORF33)的真核表达系统，并对ORF104和ORF33潜在相互作用进行分析。实验首先通过特异性PCR扩增技术得到orf 104和orf 33的基因序列，根据其编码蛋白的理化性质、跨膜区与三维结构等生物信息学分析结果，选择pCDNA3.1(+)构建两种基因的重组表达质粒。重组质粒经大肠杆菌扩增、提取后，利用转染试剂Lipo8000?将pCDNA3.1(+)-orf 104与pCDNA3.1(+)-orf 33分别单独或共转染至HEK293t。然后，将转染后的细胞培养18 h后裂解收集蛋白。最后利用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)与负染电镜检测两种目的蛋白的表达情况。结果显示，实验成功构建了OsHV-1衣壳蛋白ORF104和ORF33的重组表达质粒载体，通过真核细胞表达得到大小约为135与35 ku的目的蛋白。研究表明，表达质粒可在真核表达系统中实现蛋白单独转染与共转染，共转染蛋白间可能存在相互作用的趋势并形成多聚体，其中，ORF33自身即可形成分子质量不同的多聚体。本研究首次利用真核表达系统开展OsHV-1关键结构蛋白的表达，为进一步开展该病毒结构蛋白功能与互作，以及病毒入侵机制研究奠定基础。

关键词：牡蛎疱疹病毒核衣壳蛋白真核表达系统蛋白多聚化

底质对硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)幼贝潜砂及相关酶活性的影响

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天津农业科学 2024年第4期30卷 12-17页

作者：余利海陈雅琦陈怡雪甄秀维郭永军李永仁天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室天津300384

为研究底质对硬壳蛤幼贝潜砂行为及相关酶活性的影响,设置5种底质,观察幼贝的潜砂过程,统计潜砂时间及潜砂率,测定呼吸代谢酶活性。结果表明:硬壳蛤幼贝潜砂率排序为泥组<粗砂泥组<细砂泥组<粗砂组<细砂组;10%硬壳蛤幼贝竖壳时间排序为... 详细信息

为研究底质对硬壳蛤幼贝潜砂行为及相关酶活性的影响,设置5种底质,观察幼贝的潜砂过程,统计潜砂时间及潜砂率,测定呼吸代谢酶活性。结果表明:硬壳蛤幼贝潜砂率排序为泥组<粗砂泥组<细砂泥组<粗砂组<细砂组;10%硬壳蛤幼贝竖壳时间排序为粗砂组<细砂组<细砂泥组<泥组<粗砂泥组;10%硬壳蛤幼贝潜砂时间排序为粗砂组<细砂组<粗砂泥组<细砂泥组<泥组;Na^(+)-K^(+)-ATP酶活性排序为粗砂泥组<细砂组<粗砂组<泥组<细砂泥组;Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活性排序为粗砂泥组<粗砂组<细砂组<细砂泥组<泥组;乳酸脱氢酶活性排序为细砂组<粗砂组<粗砂泥组<泥组<细砂泥组;琥珀酸脱氢酶活性排序为粗砂泥组<细砂泥组<泥组<细砂组<粗砂组。综合分析,细砂底质更适合于作为硬壳蛤幼贝养殖的底质。

关键词：硬壳蛤底质潜砂呼吸代谢酶

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喷锚技术在八一林隧洞施工中的应用

水力发电 1989年第1期16卷 26-30,25页

作者：李永仁中国三峡工程开发总公司筹建处

引滦入还工程八一林隧洞采用喷锚支护作为永久衬砌,是喷锚技术在水工隧洞设计、施工中应用的推广。根据长隧洞特点,八一林隧洞按地质分段做了多方案有限元分析和喷锚支护计算。计算中考虑了工程效应和施工过程的影响,并同量测数据相印证... 详细信息

引滦入还工程八一林隧洞采用喷锚支护作为永久衬砌,是喷锚技术在水工隧洞设计、施工中应用的推广。根据长隧洞特点,八一林隧洞按地质分段做了多方案有限元分析和喷锚支护计算。计算中考虑了工程效应和施工过程的影响,并同量测数据相印证,进行反馈设计,最终根据围岩构造、岩性和有限元计算成果确定不同型式的喷锚结构。喷锚支护的实施是通过光面爆破、适时支护和量测预报完成的,施工中未发生过重大机械、人身事故,取得了较好的经济效益。

关键词：喷锚技术水工隧洞

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威海市:多头并举培植海洋经济增长点

中国水产 2000年第2期 54-55页

作者：李永仁

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栉孔扇贝四倍体诱导机理的初步研究

栉孔扇贝四倍体诱导机理的初步研究

作者：李永仁中国科学院研究生院（海洋研究所）

学位级别：硕士

本文采用细胞松弛素 B(CB)处理,抑制栉孔扇贝(Chlamys ferreri)受精卵第一极体(PB1)排放,研究了抑制 PB1 释放对受精卵减数分裂过程及胚胎倍性组成的影响以及四倍体胚胎和早期幼虫的生长发育,初步探明栉孔扇贝四倍体诱导的机理,对贝类... 详细信息

本文采用细胞松弛素 B(CB)处理,抑制栉孔扇贝(Chlamys ferreri)受精卵第一极体(PB1)排放,研究了抑制 PB1 释放对受精卵减数分裂过程及胚胎倍性组成的影响以及四倍体胚胎和早期幼虫的生长发育,初步探明栉孔扇贝四倍体诱导的机理,对贝类四倍体技术的完善具有重要参考价值。采用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的抗 α 管蛋白(anti-α-tubulin, Sigma)特异性地标记纺锤体,同时采用碘化丙锭 P(IPropidium iodide,Sigma)标记染色体,建立了一项免疫荧光显微观察技术,有效实施栉孔扇贝受精卵纺锤体装配和染色体分离动态的观察。PB1 排放受抑制的受精卵进入第二次减数分裂时,出现多种类型减数分裂纺锤体及相应的染色体分离形式,包括二极分离(18.9%)、三极分离(38.9%)、双二极分离(16.5%)、非同步分离(2.9%)和紊乱分离(23.0%)等。二极分离和双二极分离分别是形成三倍体和四倍体的主要细胞学机制,而其他的染色体分离行为将主要形成非整倍体。抑制 PB1 对减数分裂的影响作用表明中心粒在减数分裂纺锤体的装配中起着重要作用。结合采用普通光学显微镜和扫描电镜手段,对诱导组及其对照组的胚胎和早期幼虫发育过程进行的观察表明,进入原肠胚期后,诱导组异常形态胚胎的比例显著高于对照组。至受精后 48 h,诱导组滞育的原肠胚和担轮幼虫比例显著高于对照组。上述观察结果表明,诱导组胚胎在原肠胚阶段出现明显的发育障碍。本研究结果表明,抑制栉孔扇贝受精卵第一极体排放,显著改变了各受精卵的减数分裂过程,纺锤体装配和染色体分离出现了复杂变化,导致形成包括四倍体等各种倍性的胚胎。但是多倍体和非整倍体胚胎在原肠胚阶段出现程度不同的发育障碍,这是该项四倍体诱导技术面临的一个严峻挑战。

关键词：栉孔扇贝多倍体减数分裂纺锤体染色体分离胚胎发育