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单核细胞趋化蛋白-1诱导肾小管上皮-肌成纤维细胞转化的作用及机制探讨

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中华医学杂志 2008年第6期88卷 400-405页

作者：李慧凛郑法雷赵班中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院肾内科 100730

目的探讨单核细胞趋化蛋白（MCP）-1诱导肾小管上皮细胞发生上皮-肌成纤维细胞转化（EMT）的作用和细胞分子机制，主要是EMT过程中Erk1／2、P38MAPK、RhoA、RhoC、Snail表达水平的变化。方法将HK-2细胞分为阴性对照组，阳性对照组（TGF-... 详细信息

目的探讨单核细胞趋化蛋白（MCP）-1诱导肾小管上皮细胞发生上皮-肌成纤维细胞转化（EMT）的作用和细胞分子机制，主要是EMT过程中Erk1／2、P38MAPK、RhoA、RhoC、Snail表达水平的变化。方法将HK-2细胞分为阴性对照组，阳性对照组（TGF-β1、5μg／L），MCP-1作用组（0．1、1、10、100μg／L），观察不同时间（12、24、48、72h）MCP-1刺激与α-SMA表达水平之间的变化。用Western印迹方法检测肾小管上皮细胞PErk1／2、Erk1／2、P-P38MAPK、P38MAPK、RhoA蛋白水平的变化，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测RhoC、Snail基因水平的变化。此外，分别观察Erk、P38MAPK、Rho信号通路的阻断剂（PD98059、SB203580、Y27632）对MCP-1诱导EMT的影响。结果在不同浓度MCP-1刺激下，HK-2细胞α-SMA mRNA及蛋白表达水平均明显增强，以1μg／L刺激下表达最强；在1μg／LMCP-1作用下，24、48、72hα-SMAm RNA及蛋白表均达显著高于阴性对照组（均P〈0．05），48h作用达到最高峰。在不同浓度（0．1、1、10、100μg／L）MCP-1刺激5min时，HK-2细胞（PErk1／2）／（Erk1／2）和（P-P38MAPK）／（P38MAPK）的比值均显著高于阴性对照组（均P〈0．05），并表现为剂量依赖性。不同浓度MCP-1刺激下RhoA蛋白水平和RhoC基因表达水平与阴性对照组比较差异均无统计学意义（均P〉0．05）。PD98059可以部分阻断MCP-1诱导的肾小管上皮细胞α-SMA蛋白表达水平，与阳性对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）；而SB203580及Y27632均不能阻断MCP-1诱导的α-SMA蛋白表达，与阳性对照组比较差异无统计学意义（均P〉0．05）。MCP-1（10、100μL）刺激下Snail基因表达水平明显升高，与阴性对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论MCP-1诱导体外培养的HK-2细胞发生EMT与上调Erk1／2信号转导通路有关，并可能与上调Snail转录因子水平有关，本研究未能证实该机制与P38MAPK信号通路及Rho信号转导通路有关。

关键词：单核细胞化学吸引蛋白质1 肾小管成纤维细胞有丝分裂素激活蛋白激酶类

低渗非离子造影剂对肾小管上皮细胞凋亡的作用及其机制

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中华肾脏病杂志 2010年第3期26卷 215-220页

作者：李慧凛张金元解放军第四五五医院肾脏科南京军区肾脏病专科中心上海200052

目的探讨低渗非离子型造影剂碘必乐诱导体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）凋亡的作用及机制。方法体外培养的HK-2细胞，分为阴性对照组、不同剂量（1．16、4．63、18．5、74、296gl/L）的碘必乐作用组（作用时间为6h）。通过流式... 详细信息

目的探讨低渗非离子型造影剂碘必乐诱导体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）凋亡的作用及机制。方法体外培养的HK-2细胞，分为阴性对照组、不同剂量（1．16、4．63、18．5、74、296gl/L）的碘必乐作用组（作用时间为6h）。通过流式细胞仪、Hoechst33258染色观察细胞凋亡的比例和形态学变化；Western印迹方法检测凋亡蛋白天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表达水平，并选取作用最强的剂量（296gl／L）刺激2、4、6、12h，观察caspase-3表达变化。选取不同剂量碘必乐作用1h，与阴性对照组比较，观察细胞外信号调节激酶（ERK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路磷酸化水平的变化，并观察不同剂量p38MAPK抑制剂SB203580对碘必乐诱导的caspase-3和Bcl-2表达的影响。结果流式细胞仪检测结果示74、296gI／L碘必乐作用下细胞凋亡率较阴性对照显著升高（均P〈0．05）。Hoechst33258染色结果示296gI／L碘必乐可致明显的细胞凋亡形态学改变，凋亡细胞核呈致密浓染或核碎裂。Western印迹检测方法表明，碘必乐以剂量和时间依赖方式诱导细胞内caspase-3表达，以296gl/L作用12h表达最强；各剂量碘必乐作用下细胞内ERK1／2磷酸化水平与阴性对照组的差异均无统计学意义（均P〉0．05），而-定剂量的碘必乐处理组细胞内p38MAPK磷酸化水平较阴性对照组显著升高（均P〈0．05）。应用p38MAPK特异性抑制剂（30μmol／L）预处理2h可以阻断细胞内p38MAPK信号通路的磷酸化，抑制碘必乐诱导的细胞内caspase-3表达并部分上调Bcl-2表达，与碘必乐阳性对照组的差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论低渗非离子型造影剂碘必乐以剂量和时问依赖方式诱导体外培养的HK-2细胞凋亡，其机制可能与上调caspase-3和下调抗凋亡蛋白Bcl-2有关，而p38MAPK信号通路的激活可能参与了该过程的调控。

关键词：造影剂肾功能不全细胞凋亡 p38丝裂原活化蛋白激酶类

肾损伤分子1在低渗造影剂肾病模型大鼠肾组织的表达及缺氧诱导因子1α对其的影响

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肾脏病与透析肾移植杂志 2010年第1期19卷 42-49页

作者：李慧凛张金元南京军区南京总医院博士后科研工作站上海解放军第四五五医院博士后培养点解放军第四五五医院南京军区肾脏病专科中心上海200052

目的:观察低渗造影剂碘必乐诱导的造影剂肾病大鼠肾小管上皮细胞损伤情况和肾损伤分子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)的表达以及缺氧诱导因子1α上调对其的影响。方法:清洁级雄性SD大鼠45只,分为对照组(CON组,n=15),造影剂肾病模型... 详细信息

目的:观察低渗造影剂碘必乐诱导的造影剂肾病大鼠肾小管上皮细胞损伤情况和肾损伤分子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)的表达以及缺氧诱导因子1α上调对其的影响。方法:清洁级雄性SD大鼠45只,分为对照组(CON组,n=15),造影剂肾病模型组(CM组,n=15)及氯化钴预处理组(Cocl2+CM组,n=15)。为建立造影剂肾病大鼠模型,应用碘必乐(3gI/kg)前,依次尾静脉注射吲哚美辛(INDO,10mg/kg)和左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME,10mg/kg)。分别于造模后第2h、12h、24h、48h、72h处死动物,并检测血肌酐值,HE染色评估肾小管损伤程度,免疫组化、Western Blot及Real time-PCR方法测定肾组织中KIM-1蛋白及mRNA表达水平。结果:(1)与对照组相比,CM组造模后第2h、12h血清肌酐值无显著性差异(P>0.05),24h、48h、72h均显著升高(P值均<0.01),显示造模成功,Cocl2+CM组较同一时间点CM组血清肌酐值显著下降(P<0.01);(2)HE染色可见CM组24h、48h、72h均出现不同程度的急性肾小管损伤,伴有上皮细胞刷状缘脱落、空泡变性、细胞脱落及再生,部分肾小管结构破坏,髓质区病变较皮质病变更严重;Cocl2+CM组较同一时间点的CM组肾损伤评分显著降低(P<0.05);(3)免疫组化、Western Blot和Real time-PCR结果表明,自造模后2h始,CM组较阴性对照组大鼠肾组织KIM-1蛋白及mRNA表达水平均显著增加(P<0.05),而Cocl2+CM组较同一时间点的CM组KIM-1表达水平显著减少(P<0.05)。结论:低渗造影剂碘必乐诱导的急性肾小管上皮细胞损伤大鼠肾组织KIM-1表达水平显著增加,较血肌酐更早的反映肾损伤,上调肾组织HIF-1α表达可以减轻肾小管上皮细胞损伤,KIM-1表达亦相应降低。

关键词：造影剂肾病肾损伤分子1 缺氧诱导因子1α 氯化钴肾小管上皮细胞损伤低渗造影剂

雷帕霉素对人肾小管上皮-肌成纤维细胞转化的抑制作用

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基础医学与临床 2007年第6期27卷 635-642页

作者：李慧凛郑法雷赵班中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院肾内科北京100730

目的探讨雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)对体外培养的人肾小管上皮细胞发生上皮肌成纤维细胞转化(Epi-thelial-Myofibroblast Transition,EMT)的作用,以及该作用与上皮细胞中锌指蛋白(Snail)基因水平变化的关系。方法体外培养的人近端肾小管... 详细信息

目的探讨雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)对体外培养的人肾小管上皮细胞发生上皮肌成纤维细胞转化(Epi-thelial-Myofibroblast Transition,EMT)的作用,以及该作用与上皮细胞中锌指蛋白(Snail)基因水平变化的关系。方法体外培养的人近端肾小管上皮细胞(HKC),分为阴性对照组、转化生长因子β-1(TGF-β1)(1μg/L)阳性对照组和TGF-β1+RAPA组。TGF-β1+RAPA组不同浓度的雷帕霉素(0.1μg/L,1μg/L,10μg/L,100μg/L)与TGF-β1(1μg/L)共同作用,各组作用时间均为48h。用间接免疫荧光双染、RT-PCR、Western Blot方法分别检测细胞平滑肌细胞肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)表达,同时用RT-PCR方法检测细胞Snail mRNA水平的变化。再选取最大作用浓度的雷帕霉素作用不同时间(12h、24h、48h、72h),用RT-PCR、Western Blot方法检测α-SMA表达水平变化。结果间接免疫荧光双染、RT-PCR、Western Blot方法检测均表明,TGF-β1阳性作用组较阴性对照组HKC细胞α-SMA mRNA及蛋白表达水平显著增强(P<0.05),而E-cadherin表达则几乎消失,Snail mRNA表达水平显著增强(P<0.05)。与阳性对照组相比,雷帕霉素(10μg/L,100μg/L)与TGF-β1共同作用组HKC细胞α-SMA mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而E-cadherin表达则有部分恢复,显著高于阳性对照组(P<0.05),而Snail mRNA表达水平比阳性对照组显著降低(P<0.05)。雷帕霉素以浓度依赖方式抑制TGF-β1诱导的HKC细胞Snail mRNA表达。结论应用体外培养的肾小管上皮细胞研究表明,雷帕霉素具有抑制肾小管上皮细胞EMT的作用。此作用可能与该药诱导的Snail表达下调有关。

关键词：肾小管上皮-肌成纤维细胞转化(EMT) 转化生长因子β-1 雷帕霉素锌指蛋白Snail

伽玛刀治疗过程中肿瘤患者发生急性肾损伤的影响因素研究

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中华肾脏病杂志 2008年第8期24卷 588-589页

作者：李慧凛张金元朱义文凌贞黄健南京军区总医院博士后科研工作站上海解放军第四五五医院博士后培养点上海200052 南京军区总医院博士后科研工作站上海解放军第四五五医院肾脏病专科中心上海200052 南京军区总医院博士后科研工作站上海解放军第四五五医院肿瘤伽玛刀治疗中心上海200052

立体定向伽玛射线治疗系统（stereotactic radiosurgery）即伽玛刀是晚期肿瘤的重要治疗方法。有文献报道，2002年我国已有10余万人接受伽玛刀治疗，约占全世界治疗总数的55％。国内外有关伽玛刀治疗过程中发生。肾损伤的文献较少，其... 详细信息

立体定向伽玛射线治疗系统（stereotactic radiosurgery）即伽玛刀是晚期肿瘤的重要治疗方法。有文献报道，2002年我国已有10余万人接受伽玛刀治疗，约占全世界治疗总数的55％。国内外有关伽玛刀治疗过程中发生。肾损伤的文献较少，其确切发生率与发病机制尚不清楚，本研究旨在观察伽玛刀治疗过程与肿瘤患者发生急性肾损伤（AKI）的关系，并分析相关危险因素。

关键词：伽玛刀治疗肿瘤患者急性肾损伤临床分析

缺氧诱导因子1α在非离子造影剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡中的作用及其机制

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肾脏病与透析肾移植杂志 2008年第4期17卷 339-346页

作者：李慧凛张金元南京军区总医院博士后科研工作站解放军第四五五医院博士后培养点上海200052 解放军第四五五医院南京军区肾脏病专科中心

目的:应用缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)诱导剂氯化钴上调HIF-1α水平,观察其对非离子造影剂碘必乐诱导的HK-2细胞凋亡的作用和机制。方法:体外培养的HK-2细胞,分为阴性对照组、碘必乐阳性对照组(296mgI/ml,1... 详细信息

目的:应用缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)诱导剂氯化钴上调HIF-1α水平,观察其对非离子造影剂碘必乐诱导的HK-2细胞凋亡的作用和机制。方法:体外培养的HK-2细胞,分为阴性对照组、碘必乐阳性对照组(296mgI/ml,12h)、不同剂量及作用时间的氯化钴预处理与碘必乐共同作用组(氯化钴浓度为5、25、50、100μmol/L,分别预处理0h、1h、2h、4h、6h、12h)。通过流式细胞仪测定细胞凋亡率,Hoechst33258染色观察细胞凋亡的形态学变化,WesternBlot方法检测HIF-1α、Caspase-3和凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平。结果:(1)流式细胞仪检测结果表明,50μmol/L氯化钴预处理4h、6h和12h点与阳性对照组相比细胞凋亡率明显降低(10.95%,8.65%,8.61%vs22.06%,P0.05)。100μmol/L与50μmol/L氯化钴预处理相同时间(6h、12h)细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);(2)Hoechst33258染色结果发现,与阳性对照组相比,50μmol/L氯化钴预处理6h和12h凋亡细胞明显减少,其它时间点与阳性对照组差异无统计学意义。(3)Western Blot检测方法表明,50μmol/L氯化钴预处理1h以上即可引起HIF-1α表达增高,6h点表达最高(0.373±0.032),12h点较前下降(0.285±0.048)。与阳性对照组相比,50μmol/L氯化钴预处理4h、6h、12h,细胞内Caspase-3水平明显降低(P<0.05,0.346±0.037,0.294±0.062,0.179±0.051vs0.501±0.039)。Bcl-2表达水平明显增加(P<0.05,0.275±0.052,0.324±0.046,0.337±0.039vs0.099±0.025)。结论:HIF-1α对非离子造影剂碘必乐诱导的人近端肾小管上皮细胞凋亡有明显的抑制作用,其作用机制可能与下调Caspase-3和上调抗凋亡蛋白Bcl-2有关。

关键词：缺氧诱导因子1α 造影剂肾病氯化钴非离子造影剂细胞凋亡

肾小管上皮细胞转分化的非Smad信号转导途径

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世界医学杂志 2004年第13期8卷 40-42页

作者：李慧凛郑法雷中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院肾内科100730

肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾功能衰竭的共同途径。肾间质纤维化的一个重要机制，就是肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(epithelial-myofibroblast transdifferentiation，EMT)或肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转... 详细信息

肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾功能衰竭的共同途径。肾间质纤维化的一个重要机制，就是肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(epithelial-myofibroblast transdifferentiation，EMT)或肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转变(epithelial-myofibroblast transition，EMT)。EMT主要表现之一是肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)增多。阻止EMT过程发生，可以减轻甚至逆转肌成纤维细胞的聚集，有望在早期逆转纤维化形成，从而真正改善慢性肾脏疾病的预后。本文着重介绍近年来有关参与EMT过程的非Smad信号转导途径。

关键词：肾小管上皮细胞细胞转化细胞分化非Smad 信号转导途径肾小管间质纤维化

低氧诱导因子1α基因转染的人脂肪源性干细胞对肾小管上皮细胞损伤的影响

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肾脏病与透析肾移植杂志 2011年第5期20卷 438-443页

作者：王巍巍李慧凛张金元王葳中国人民解放军第四五五医院肾脏科南京军区肾脏专科中心上海200052

目的:将低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因质粒高效感染人脂肪源性干细胞(hADSCs),并与顺铂诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)共孵育,观察hADSCs对HK-2细胞损伤的影响。方法:以慢病毒为载体,将HIF-1α转染hADSCs,与顺铂诱导的HK-2细胞共孵... 详细信息

目的:将低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因质粒高效感染人脂肪源性干细胞(hADSCs),并与顺铂诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)共孵育,观察hADSCs对HK-2细胞损伤的影响。方法:以慢病毒为载体,将HIF-1α转染hADSCs,与顺铂诱导的HK-2细胞共孵育。电镜观察HK-2细胞形态、结构的变化;原位末端标记(TUNEL)检测细胞凋亡指数;Westernblot检测HK-2细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病2基因(Bcl-2)的变化及hADSCs细胞促红细胞生成素(EPO)、血红素氧化酶1(HO-1)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达,ELISA检测培养液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子1(KIM-1)的浓度,EPO、HO-1、VEGF和HIF-1α的浓度变化。结果:(1)与顺铂诱导组相比,共孵育后的HK-2细胞结构损伤减轻、凋亡细胞减少,caspase-3的表达低于顺铂诱导组、Bcl-2的表达水平升高;其中HIF-1α转染的hADSCs与HK-2细胞共孵育后,HK-2细胞损伤明显减轻,凋亡蛋白的变化更为明显。(2)顺铂诱导组培养液中NGAL、KIM-1浓度升高,以KIM-1变化明显(P<0.05);细胞共孵育后培养液中KIM-1浓度降低,转染组较明显。(3)转染后的hADSCs细胞内EPO、HO-1、VEGF的蛋白表达升高;培养液中HO-1、VEGF含量增高(P<0.05),HIF-1α、EPO的含量变化不明显。结论:hADSCs与HK-2细胞共孵育后,可以减轻顺铂诱导的HK-2细胞结构损伤、抑制细胞凋亡,HIF-1α转染hADSCs后其作用更为明显,可能与细胞保护因子的高表达有关。

关键词：低氧诱导因子1α 人脂肪源性干细胞基因转染肾小管上皮细胞

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肾小管上皮细胞转分化的概念与病理过程

世界医学杂志 2004年第13期8卷 34-35,42页

作者：李慧凛周秋根郑法雷中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院肾内科100730

肾间质纤维化的一个重要机制就是肌成纤维细胞(MYOfibroblast，MyoF)增多及活化。MyoF是间质中合成细胞外基质的主要细胞，而细胞外基质的增多直接导致了肾脏纤维化进行性发展。尽管目前MyoF的来源还不完全明确，但近年研究发现其来源... 详细信息

肾间质纤维化的一个重要机制就是肌成纤维细胞(MYOfibroblast，MyoF)增多及活化。MyoF是间质中合成细胞外基质的主要细胞，而细胞外基质的增多直接导致了肾脏纤维化进行性发展。尽管目前MyoF的来源还不完全明确，但近年研究发现其来源除了由成纤维细胞活化而来，还有相当一部分来源于肾小管上皮细胞，即小管上皮细胞通过某种机制转变成MyoF，部分学者称其为“上皮细胞一肌成纤维细胞转分化”(ePithelial-myofibrOblast transdifferentiation，EMT)，或“上皮细胞一肌成纤维细胞表型转变”(epithelial-myofibroblast transition，EMT)。越来越多的体内、体外实验证据支持这一现象的存在，因此EMT是肾小管间质纤维化发生并进而导致终末期肾功能衰竭的主要途径之一。本文着重介绍近年来关于EMT的概念和有关病理过程。

关键词：肾小管上皮细胞细胞转化细胞分化肾间质纤维化蛋白激酶