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循环包装回收技术在筛选肝癌细胞相关耐药基因中的应用

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生物工程学报 2016年第2期32卷 204-211页

作者：戴文燕朱瑞宇金坚江南大学药学院江苏无锡214122

肝癌先天性多表达多药耐药基因,严重影响肝癌的化疗效果,筛选肝癌细胞中的耐药基因,研究其耐药机制有助于提高肝癌化疗效果,提高肝癌的治愈率。首先构建肝癌细胞逆转录病毒的cDNA文库,感染成纤维细胞,使得逆转录病毒基因整合进细胞,加... 详细信息

肝癌先天性多表达多药耐药基因,严重影响肝癌的化疗效果,筛选肝癌细胞中的耐药基因,研究其耐药机制有助于提高肝癌化疗效果,提高肝癌的治愈率。首先构建肝癌细胞逆转录病毒的cDNA文库,感染成纤维细胞,使得逆转录病毒基因整合进细胞,加药筛选,存活细胞中的基因再次包装成病毒,用于下一轮筛选。采用循环包装回收(Cyclical packaging rescue,CPR)技术进行肝癌细胞耐药基因的筛选即是通过病毒包装将基因从细胞中钓取出来,相比于常规筛选方法,仅通过一轮筛选可能会出现很多假阳性基因,采用CPR技术则是通过多轮筛选,很大程度减少了假阳性细胞的出现。通过该方法经过四轮筛选获得核糖体蛋白S11(RPS11)、核糖体蛋白L6(RPL6)、核糖体蛋白L11(RPL11)、核糖体蛋白L24(RPL24)等几种基因,经初步检测,增加了细胞的耐药性。

关键词：循环包装回收技术肝癌 cDNA文库耐药基因

人乳腺癌细胞及其耐药细胞转录因子表达的差异

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中国药理学通报 2012年第9期28卷 1257-1262页

作者：陈淑娴朱瑞宇付强金坚江南大学医药学院细胞与分子药理研究室江苏无锡214122 江苏省原子医学研究所分子生物中心江苏无锡214063

目的研究阿霉素在不同药敏性肿瘤细胞中转录因子水平的差异,为肿瘤细胞多药耐药机制的研究提供参考。方法通过细胞活力检测野生型乳腺癌细胞(MCF7/W)和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞(MCF7/ADM)的药敏性差异;荧光显微镜镜检阿霉素荧光分布;... 详细信息

目的研究阿霉素在不同药敏性肿瘤细胞中转录因子水平的差异,为肿瘤细胞多药耐药机制的研究提供参考。方法通过细胞活力检测野生型乳腺癌细胞(MCF7/W)和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞(MCF7/ADM)的药敏性差异;荧光显微镜镜检阿霉素荧光分布;有机溶剂萃取法进行全细胞阿霉素吸收分析;细胞膜和核膜分离检测阿霉素的亚细胞定位;通过转录因子膜分析MCF7/W和MCF7/ADM细胞中转录因子表达差异。结果两株细胞的耐药IC50相差近10 000倍左右;利用镜检和定量分析,发现阿霉素在MCF7/W细胞中主要定位于胞核,而在MCF7/ADM细胞中则蓄积较少且主要定位于胞质;转录因子差异分析发现膜上总345个转录因子中,与野生型细胞相比,耐药细胞的106个转录因子表达上调,32个表达下调。结论阿霉素在耐药细胞与野生型细胞中转录因子表达的差异,可能是干扰阿霉素入核,阻止其功能发挥的基础。

关键词： MCF-7/ADM 阿霉素 IC50 转录因子耐药细胞亚细胞定位

重组人血管内皮生长因子165b在毕赤酵母中的表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2013年第7期26卷 966-968,973页

作者：戴惠云朱瑞宇雷楗勇侯颖陈蕴金坚江南大学药学院江苏无锡214122

目的在毕赤酵母中表达重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)165b(rhVEGF-165b),并进行纯化。方法 PCR扩增hVEGF165b基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b,SalⅠ酶切线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达产物经Ni-NTA sephrose镍柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b经双酶切和测序,证明构建正确;表达的rhVEGF165b蛋白相对分子质量约为23 000,纯化后纯度达90%以上,具有人VEGF的抗原性。结论成功在毕赤酵母中表达了rhVEGF165b蛋白,纯化的蛋白纯度较高,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

关键词：血管内皮生长因子165b 毕赤酵母表达纯化

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双缺陷型毕赤酵母X33突变株的诱变育种

食品与生物技术学报 2016年第2期35卷 129-135页

作者：顾鹏飞李萌朱瑞宇金坚江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学药学院江苏无锡214122

为促进Pichia pastoris X33α-1,6-甘露糖转移酶(OCH1p)与α-1,3-甘露糖转移酶(ALG3p)双突变菌株(och1 alg3 m X33)作为蛋白质表达宿主菌的应用,为双突变菌株进一步糖基化的研究奠定基础。作者通过紫外诱变和常压室温等离子体(ARTP)诱... 详细信息

为促进Pichia pastoris X33α-1,6-甘露糖转移酶(OCH1p)与α-1,3-甘露糖转移酶(ALG3p)双突变菌株(och1 alg3 m X33)作为蛋白质表达宿主菌的应用,为双突变菌株进一步糖基化的研究奠定基础。作者通过紫外诱变和常压室温等离子体(ARTP)诱变的方法来提高双突变菌株的生长速度以及适应能力。经过4轮筛选发现了生长速度提高15%、温度敏感性有所降低、细胞存活率有所提高的双突变菌株。

关键词：糖基化诱变生长表型甘露糖转移酶

转录激活因子1(ATF1)内部核糖体进入位点的鉴定及活性分析

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中国生物化学与分子生物学报 2015年第9期31卷 937-943页

作者：李琪高文青朱瑞宇金坚江南大学药学院分子药理实验室江苏无锡214122

蛋白质翻译起始通常有两种机制,一是依赖帽结构的翻译,另一种是依赖5'非翻译区的内部核糖体进入位点(IRES).在后一种方式中,在某些IRES反式作用因子,如La蛋白、多聚嘧啶串结合蛋白1等的参与下,直接招募核糖体小亚基到mRNA的翻译起始位点... 详细信息

蛋白质翻译起始通常有两种机制,一是依赖帽结构的翻译,另一种是依赖5'非翻译区的内部核糖体进入位点(IRES).在后一种方式中,在某些IRES反式作用因子,如La蛋白、多聚嘧啶串结合蛋白1等的参与下,直接招募核糖体小亚基到mRNA的翻译起始位点,启始翻译.研究发现,参与细胞生长、分化、细胞周期进程、凋亡和压力调控的相关蛋白中通常含有IRES元件.基于功能,我们提出假说:转录激活因子1(ATF1)的5'-UTR可能具有IRES活性.为验证假说,首先构建了含全长ATF1 5'-UTR的双荧光素酶报告质粒;质粒转染结合报告酶活性分析显示,ATF1 5'-UTR在Bel7402、HCT-8和HEK293细胞中表现出不同的IRES活性;而此IRES活性与5'-UTR中的隐藏启动子无关.同时还发现,ATF1 5'-UTR在NIH3T3细胞中却没有IRES活性.与此结果相一致,Western印迹检测ATF1在这几种细胞系中的表达.结果显示,Bel7402、HCT-8和HEK293中ATF1蛋白质表达水平较高,而在NIH3T3中却极低.ATF1 5'-UTR的系列5'-删除突变及报告酶分析证明,ATF1 5'-UTR的完整性对其IRES活性大小发挥重要作用;其中5'端的204 bp序列对其IRES活性贡献较大.RNA-蛋白免疫共沉淀实验揭示,ATF1 5'-UTR可与La和PTBP1蛋白结合;抑制La和PTBP1蛋白质的表达,并可减低HEK293细胞中ATF1蛋白质表达水平.这些结果提示,La和PTBP1蛋白(两种ITAFs)为ATF1 5'-UTR发挥IRES活性所必需.总之,上述结果证明,ATF1 5'-UTR具有IRES活性,其活性发挥依赖与La和PTBP1蛋白的结合.上述发现为进一步研究La和PTBP1表达及亚细胞定位对ATF1 IRES调控机制的影响奠定了基础.

关键词：转录激活因子1(ATF1) 5'-非编码区(5'-UTR) 内部核糖体进入位点(IRES) IRES反式作用因子(ITAFs)

毕赤酵母X-33OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF

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微生物学报 2011年第5期51卷 622-629页

作者：张大成许永利辛鑫朱瑞宇金坚江南大学生物工程学院无锡214122 江南大学医药学院无锡214122

【目的】酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰,产生高甘露糖型糖链,影响蛋白的活性,其中α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)在这一过程中起着关键作用。通过敲除毕赤酵母X-33的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得一个对糖蛋白... 详细信息

【目的】酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰,产生高甘露糖型糖链,影响蛋白的活性,其中α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)在这一过程中起着关键作用。通过敲除毕赤酵母X-33的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统。【方法】采用双交换同源重组敲除目的基因的方法,首先敲除毕赤酵母X-33的URA3基因,获得一个尿嘧啶营养缺陷型的X-33(ura3-)菌株;然后用URA3基因作为选择标记,敲除X-33(ura3-)的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得OCH1基因敲除的X-33(och1-)菌株。用X-33(och1-)菌表达糖蛋白GM-CSF,分析GM-CSF蛋白糖链的变化。【结果】首次成功敲除了X-33的URA3和OCH1基因,与野生型相比,X-33(och1-)菌表达的GM-CSF蛋白过度糖基化修饰程度明显降低。【结论】X-33(och1-)菌株的构建提供了一个对蛋白低N-糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,也为进一步的糖基化改造提供了良好的基础。

关键词： N-糖基化毕赤酵母X-33 基因敲除粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)

双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达

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中国生物制品学杂志 2012年第9期25卷 1130-1134页

作者：高明珠朱瑞宇陈蕴金坚江南大学医药学院药物设计与分子药理学实验室江苏无锡214122

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点... 详细信息

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。

关键词：启动子基因,报告真核细胞基因表达

脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点活性的研究

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中国生物工程杂志 2011年第2期31卷 12-17页

作者：蔡燕飞朱瑞宇陈蕴金坚江南大学医药学院药物设计与分子药理学实验室无锡214122

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site,IRES)已被广泛运用于蛋白的表达中,如应用于Clontech公司推出的pIRES2质粒对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。但是由于对EMCV的IRES了解还不够深入而在利用EMCV的IRES进行基因表达过程中经常会遇到问题,很有必要对其进行更深入的研究。以红绿色荧光蛋白基因作为报告基因,通过分子克隆、荧光显微镜、荧光分光光度计、Western blot等分子细胞生物学手段,对EMCV的IRES末端序列与其活性的关系进行了深入研究。研究发现EMCV的IRES末端序列对其IRES的活性影响极大,而人们常用的报告基因EGFP本身也可能存在IRES。

关键词：脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点增强型绿色荧光蛋白

内部核糖体进入位点(IRES)调控多种癌细胞系中尾型同源盒转录因子2的翻译

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中国生物化学与分子生物学报 2017年第3期33卷 260-268页

作者：高文青李琪陈蕴朱瑞宇金坚江南大学药学院分子药理实验室江苏无锡214122

尾型同源盒转录因子2(caudal type homeobox transcription factor 2,CDX2)促进肠癌细胞增殖,并具有致瘤的潜能。然而,对于CDX2翻译水平的调控机制研究甚少。本研究基于转染及报告酶活性分析结果,首次证明CDX2 5'非翻译区(5'untranslate... 详细信息

尾型同源盒转录因子2(caudal type homeobox transcription factor 2,CDX2)促进肠癌细胞增殖,并具有致瘤的潜能。然而,对于CDX2翻译水平的调控机制研究甚少。本研究基于转染及报告酶活性分析结果,首次证明CDX2 5'非翻译区(5'untranslated region,5'-UTR)存在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),并通过IRES在HEK293细胞以及肝癌、肠癌和卵巢癌等肿瘤细胞株中介导翻译起始。IRES介导的翻译机制与经典的帽依赖翻译途径(cap-dependent translation)不同,在一些IRES反式作用因子(IRES trans-acting factors,ITAFs)的作用下,不需要帽状结构,IRES可以直接招募核糖体小亚基,起始翻译。同时,肿瘤细胞内IRES介导的翻译方式可能是引起蛋白质异常表达的原因之一。通过Western印迹检测CDX2在4种肿瘤细胞系中的表达,发现CDX2的IRES活性与其在肿瘤细胞中蛋白质表达量正相关,其活性在耐药型卵巢肿瘤细胞株中最高。此外,CDX2 IRES元件的5'端截短及报告酶活性分析证明,CDX2 5'-UTR的活性中心位于68~147碱基之间,而位于5'末端的67个碱基形成一个远端茎环,抑制全长IRES的活性。定点突变68~147活性区域的实验结果揭示,3个茎环结构域(68GCCGGC73,88GCCAG92和114CUCUG118)是IRES元件中不可或缺的部分。上述结果证明,CDX2 5'-UTR具有IRES活性,其活性依赖于二级茎环结构。因此,可以针对特殊的茎环结构域进行研究,使之成为肿瘤药物作用靶点。

关键词：尾型同源盒转录因子2 5'非编码区内部核糖体进入位点