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草鱼出血病细胞疫苗微囊制备与体外释放研究

上海海洋大学学报 2013年第2期22卷 212-218页

作者：李瑞伟曾令兵张辉肖艺周勇范玉顶刘秋凤孙建滨上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院长江水产研究所湖北武汉430223 华中农业大学水产学院湖北武汉430070

以海藻酸钠、壳聚糖以及草鱼出血病细胞灭活疫苗为原材料,采用复凝聚法制备草鱼出血病口服微囊疫苗。通过单因素试验和正交试验,研究了海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、氯化钙浓度以及加入疫苗体积对微囊疫苗包封率的影响,确定了其最佳制备... 详细信息

以海藻酸钠、壳聚糖以及草鱼出血病细胞灭活疫苗为原材料,采用复凝聚法制备草鱼出血病口服微囊疫苗。通过单因素试验和正交试验,研究了海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、氯化钙浓度以及加入疫苗体积对微囊疫苗包封率的影响,确定了其最佳制备工艺。结果显示,各因素对草鱼出血病微囊疫苗包封率的影响程度由大到小依次为:海藻酸钠浓度>疫苗加入量>壳聚糖浓度>氯化钙浓度;制备草鱼出血病微囊疫苗的最佳工艺为:海藻酸钠浓度为1.5%,壳聚糖浓度为1%,氯化钙浓度为4%,加入疫苗体积为2 mL。该微囊疫苗平均粒径为(7.02±3.95)μm,平均包封率为60.53%,平均载蛋白量为8.12 mg/g,在pH 7.4的PBS溶液、生理盐水溶液中具有良好的释放性能。

关键词：草鱼出血病细胞疫苗海藻酸钠壳聚糖微囊制备工艺

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施氏鲟出血性败血症病原菌的分离和鉴定

华中农业大学学报 2007年第6期26卷 822-826页

作者：孟彦肖汉兵张林李罗新曾令兵中国水产科学研究院淡水生态与健康养殖重点开放实验室荆州434000 农业部淡水鱼类种质资源与生物技术重点开放实验室荆州434000

从患典型出血性败血症死亡的施氏鲟(Acipenser schrenckiiBrandt)脾脏组织分离到1株致病性病原菌。依Koch法则建立室内感染模型,一次感染试验和回归感染试验的试验组均可复制出与自然发病情况下相同的症状,根据Reed-Muench法计算病原菌... 详细信息

从患典型出血性败血症死亡的施氏鲟(Acipenser schrenckiiBrandt)脾脏组织分离到1株致病性病原菌。依Koch法则建立室内感染模型,一次感染试验和回归感染试验的试验组均可复制出与自然发病情况下相同的症状,根据Reed-Muench法计算病原菌半数致死浓度为1.17×107cfu/mL。对从自然发病和一次感染试验的病鱼体内分离的致病菌进行形态和VITEK全自动细菌生理生化表型鉴定以及16S rRNA基因部分序列进化树分析,结果表明导致施氏鲟出血性败血症的病原菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。药物敏感试验结果显示,该病原菌对庆大霉素、环丙沙星、阿米卡星等药物敏感,对氨卞青霉素、舒巴坦、头孢唑啉等药物具有抗性。

关键词：施氏鲟出血性败血症病原分离鉴定嗜水气单胞菌

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白与大肠杆菌LTB亚基植物融合表达载体的构建

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中国水产科学 2011年第1期18卷 1-7页

作者：周勇曾令兵范玉顶罗晓松徐进肖艺中国水产科学研究院长江水产研究所华中农业大学水产学院

根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板,进行RT-PCR扩增,得到约1.3 kb的GCRV VP6基因读码框片段,同时提取大肠杆菌(Escherichia coli)H44815全基因组作为模板,进行PCR扩增得到约370 bp的LTB基因读码框片段。将获得的2个目的片段分别克隆到pCR2.1载体上,经酶切、PCR扩增检测和序列测定确认后,将其克隆到携带绿色荧光蛋白标记的植物表达载体pCAMBIA1302上,成功构建了可将草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白、大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、绿色荧光蛋白(GFP)融合表达的植物载体pCAMBIA 1302-LTB-VP6。本研究旨为草鱼出血病可饲化转基因植物疫苗研制奠定基础。

关键词：草鱼出血病呼肠孤病毒 VP6基因 LTB基因植物表达载体

斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因shRNA干扰载体的构建及效果评价

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水产学报 2012年第3期36卷 343-349页

作者：黄桂菊陈健光喻达辉曾令兵龙华中国水产科学研究院南海水产研究所农业部海水养殖生态与质量控制重点开放实验室中国水产科学研究院长江水产研究所农业部淡水鱼类种质资源与生物技术重点开放实验室中国水产科学研究院长江水产研究所淡水生态与健康养殖重点开放实验室

利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干... 详细信息

利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化。结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47%、68%、51%。3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好。Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60%、96%和55%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础。

关键词：斜带石斑鱼神经坏死病毒 CP基因 shRNA干扰载体

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湖北京山苏家垄墓群M85发掘简报

江汉考古 2018年第1期 26-33,F0002页

作者：方勤胡长春向其华尚如春余乐杨力曾令兵湖北省文物考古研究所湖北武汉430077

2015~2017年,湖北省文物考古研究所等单位对京山苏家垄墓群进行考古发掘,清理墓葬一百余座,M85为其中一座小型土坑竖穴墓,出土陶器、青铜器及玉器等13件(套)。墓葬年代大致为春秋中期,丰富了苏家垄墓群的文化内涵,为研究曾国及曾楚关系... 详细信息

2015~2017年,湖北省文物考古研究所等单位对京山苏家垄墓群进行考古发掘,清理墓葬一百余座,M85为其中一座小型土坑竖穴墓,出土陶器、青铜器及玉器等13件(套)。墓葬年代大致为春秋中期,丰富了苏家垄墓群的文化内涵,为研究曾国及曾楚关系提供了新材料。

关键词：苏家垄墓群 M85 曾国

氰戊菊酯对鲤SOD活性和MDA含量以及肝肾细胞形态的影响

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华中农业大学学报 2012年第4期31卷 499-505页

作者：闫海燕曾令兵罗宇良潘镜张婷华中农业大学水产学院武汉430070 中国水产科学研究院淡水生态与健康养殖重点开放实验室/中国水产科学研究院长江水产研究所武汉430223 云南新海丰食品有限公司曲靖655800

通过不同质量浓度的氰戊菊酯对鲤进行21d半静置染毒,测定不同时间血清、肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的变化,观察染毒后氰戊菊酯对鲤肝、肾组织结构的影响。结果表明:暴露于氰戊菊酯中的鲤,肝脏及血清中SOD活性... 详细信息

通过不同质量浓度的氰戊菊酯对鲤进行21d半静置染毒,测定不同时间血清、肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的变化,观察染毒后氰戊菊酯对鲤肝、肾组织结构的影响。结果表明:暴露于氰戊菊酯中的鲤,肝脏及血清中SOD活性均呈现先上升后降低的变化规律,且血清中SOD活性变化先于肝脏中的变化,暴露21d后活性极显著低于空白对照组;而MDA含量均随着暴露时间的延长显著增加,上升时间主要集中在暴露后的第3～14天。苏木精-伊红染色显示,鲤肝血窦扩张充血,肝细胞空泡变性及溶解并形成局部坏死病灶等,0.8μg/L染毒第21天、4.05μg/L和20.25μg/L染毒3d后上述损伤明显;鲤肾间质细胞增多,炎性细胞浸润,部分肾小管与基底膜分离,管壁细胞水样变性,高剂量组染毒21d还兼有肾小球萎缩,大量含铁血黄素沉着等。超显微观察发现,高剂量染毒21d肝细胞核萎缩,核内异形染色体边集化、粗面内质网水肿、松散甚至断裂,胞质中出现空泡,脂滴大量增多等。以上损伤不仅具有剂量相关性,还具有时间积累效应。

关键词：氰戊菊酯鲤超氧化物歧化酶丙二醛组织病理学肝肾

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水产生物安保发展趋势与政策建议

中国工程科学 2016年第3期18卷 15-21页

作者：黄倢曾令兵董宣梁艳谢国驷张庆利中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室山东青岛266071 中国水产科学研究院长江水产研究所武汉430223

本文基于我国水产养殖疫病防控发展的现状和趋势,对我国水产生物安保需求形势形成基本判断。针对水产养殖业"十三五"发展规划,凝练出水产生物安保的战略目标、基本原则和战略重点,并提出了"以生物安保为指导调整我国水产养殖业发展政策"... 详细信息

本文基于我国水产养殖疫病防控发展的现状和趋势,对我国水产生物安保需求形势形成基本判断。针对水产养殖业"十三五"发展规划,凝练出水产生物安保的战略目标、基本原则和战略重点,并提出了"以生物安保为指导调整我国水产养殖业发展政策""积极与国际接轨提升我国水生动物卫生管理水平"和"尽快实施一批水产生物安保科技重点研发计划"等重大建议;指出应认清生物安保属国家生态安全的战略地位,是行业执政能力的反映,应以生物安保为核心引领我国水产养殖业的技术升级与结构调整,并尽快重点抓好国家级和省级原良种场的生物安保,为我国水产养殖业的健康可持续发展提供支撑。

关键词：水产健康生物安保 “十三五”规划可持续发展生态安全

湖北地区克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区ORF14/15、ORF23/24基因序列比较分析

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淡水渔业 2017年第5期47卷 64-71页

作者：杨星刘文枝马杰周勇范玉顶曾令兵华中农业大学水产学院中国水产科学研究院长江水产研究所

试验扩增、克隆了在湖北地区采集的19份克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)阳性样品的变异区ORF14/15和ORF23/24基因,通过测序比较分析了湖北各WSSV毒株与Gen Bank公布的标准毒株间在变异... 详细信息

试验扩增、克隆了在湖北地区采集的19份克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)阳性样品的变异区ORF14/15和ORF23/24基因,通过测序比较分析了湖北各WSSV毒株与Gen Bank公布的标准毒株间在变异区ORF14/15及ORF23/24基因的差异性。结果显示,19份WSSV阳性样品中有部分样品在变异区扩增出ORF14/15、ORF23/24基因片段,变异区基因序列分析发现,与Gen Bank已公布的标准毒株相比,存在大片段缺失。在变异区ORF14/15,有3个毒株扩增出1 442 bp的片段,4个毒株扩增出630 bp的片段,基于变异区ORF14/15构建的系统进化树显示,这些毒株归属两个不同的分支。在变异区ORF23/24,有2个毒株扩增出大小为2 096 bp的片段,进化分析发现这2个毒株在变异区ORF23/24的遗传距离较近。

关键词：克氏原螯虾(Procambarus clarkii) 白斑综合征病毒 ORF14/15 ORF23/24 序列分析

不同基因型草鱼呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法的建立及应用

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淡水渔业 2018年第6期48卷 9-16页

作者：范玉顶马杰周勇江南刘文枝曾令兵中国水产科学研究院长江水产研究所武汉430223 爱达荷大学水产研究所鱼类与野生动物科学系

根据Gen Bank登录的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同基因型毒株编码VP2蛋白的S2节段保守序列,设计1对简并引物,通过优化反应条件及灵敏度和特异性评价,建立了一种能同时检测三种基因型GCRV的通用RT-PCR检测方法。结果显示... 详细信息

根据Gen Bank登录的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同基因型毒株编码VP2蛋白的S2节段保守序列,设计1对简并引物,通过优化反应条件及灵敏度和特异性评价,建立了一种能同时检测三种基因型GCRV的通用RT-PCR检测方法。结果显示:该方法在三种基因型GCRV中均扩增出大小约590 bp的特异性条带;灵敏度试验结果显示,该方法对于I、Ⅱ、Ⅲ型GCRV的检测限分别为380、250和380拷贝/μL。该方法可特异性地检测目前已知的三种基因型GCRV,而在大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)中无扩增产物。利用该方法检测49份草鱼出血病疑似样品,结果显示均为GCRV阳性,其中I型阳性率为8. 2%,Ⅱ型阳性率为85. 7%,Ⅲ型阳性率为2%,I、Ⅱ型混合感染阳性率为4. 1%,其他类型的混合感染未检测到。结果表明,本研究建立的针对I、Ⅱ和Ⅲ型GCRV的RT-PCR检测方法具有通用性好、省时高效的突出特点,同时还兼具较高的灵敏度和特异性。

关键词：不同基因型草鱼呼肠孤病毒简并引物 RT-PCR VP2蛋白快速检测