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5种猪场常用消毒剂对PCV2和PRV的消毒效果评价

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中国动物检疫 2024年第6期41卷 107-114页

作者：董林谢金文刘吉山曲光刚王艳萍魏凤沈志强山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

为评价含碘类、季铵盐类、过硫酸氢钾类、二氧化氯类和戊二醛类5种猪场常用消毒剂的安全性及其对病毒的消毒效果,在实验室、模拟猪场舍条件下,分别采用病毒悬液法、细胞培养病变法,根据说明书推荐的稀释比例,选择高、中、低3个工作浓度,... 详细信息

为评价含碘类、季铵盐类、过硫酸氢钾类、二氧化氯类和戊二醛类5种猪场常用消毒剂的安全性及其对病毒的消毒效果,在实验室、模拟猪场舍条件下,分别采用病毒悬液法、细胞培养病变法,根据说明书推荐的稀释比例,选择高、中、低3个工作浓度,与PCV2和PRV分别作用不同时间后接种细胞培养,观察细胞病变,通过TCID50计算病毒灭活率,荧光定量PCR检测病毒核酸含量。结果显示:含碘类和二氧化氯类消毒剂对细胞毒性较小,戊二醛类消毒剂对细胞的毒性相对较强。5类消毒剂对PCV2和PRV均有一定的杀灭效果,工作浓度越低,灭活时间越长;实验室条件下,含碘类、过硫酸氢钾类、二氧化氯类消毒剂显示出较强的消毒效果,在高、中工作浓度下10 min内即可100%灭活病毒,而猪场模拟条件下,含碘类消毒剂的实际消毒效果较差,季铵盐类消毒剂的核酸去除能力较弱。结果表明:所选用的5种常用消毒剂均可用于猪场消毒,可根据实际条件和需求选用;在保证安全的前提下,应尽量使用较高的工作浓度,且保证足够的消毒时间。本研究确定了5种常用消毒剂的病毒灭活效果与其工作浓度、消毒作用时间的关联性,为猪场消毒剂的选择与使用提供了参考。

关键词：消毒剂猪伪狂犬病病毒猪圆环病毒消毒效果

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间接竞争ELISA法检测谷物中T-2毒素

中国粮油学报 2014年第6期29卷 118-121页

作者：唐世云武玉香曲光刚付石军沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院滨州256600 山东绿都生物科技有限公司滨州256600

T-2毒素是单端孢霉烯族毒素的重要代表，在单端孢霉烯族毒素中毒性最强，是主要的食品污染源之一，用间接竞争酶联免疫分析法（ELISA）对谷物中的T-2毒素进行了测定。从样品的处理、T-2毒素的添加回收及ELISA的实验检测等方面进行试验... 详细信息

T-2毒素是单端孢霉烯族毒素的重要代表，在单端孢霉烯族毒素中毒性最强，是主要的食品污染源之一，用间接竞争酶联免疫分析法（ELISA）对谷物中的T-2毒素进行了测定。从样品的处理、T-2毒素的添加回收及ELISA的实验检测等方面进行试验，最终结果用分析软件分析相关数据得到相关系数为0．998，IC5。为1．3μg/kg，标准品浓度为0-16．2μg／kg，灵敏度为0．2μg／kg，添加回收率均大于90％。该法测定T-2毒素方法简便，特异性高，灵敏度高，重复性好，适合用于检测谷物中的T－2毒素。

关键词：间接竞争酶联免疫分析 T-2毒素谷物

猪圆环病毒2型ORF2与EGFP融合蛋白表达载体的构建及在鸭心肌细胞中的表达

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中国兽医科学 2011年第10期41卷 1047-1051页

作者：王文秀沈志强吕素芳曲光刚谢金文董林山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600

为研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在异源细胞上的表达及生物学特性,构建了PCV2ORF2与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP-N1-ORF2。采用脂质体法转染体外培养的鸭心肌细胞后,通过直接荧光观察EGFP-ORF2融合蛋白在... 详细信息

为研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在异源细胞上的表达及生物学特性,构建了PCV2ORF2与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP-N1-ORF2。采用脂质体法转染体外培养的鸭心肌细胞后,通过直接荧光观察EGFP-ORF2融合蛋白在鸭心肌细胞中的分布定位,经RT-PCR、间接免疫荧光方法检测ORF2基因在鸭心肌细胞中的表达。结果显示,转染48 h后有绿色荧光出现,RT-PCR和间接免疫荧光法检测均为阳性。证实,PCV2 ORF2基因在鸭心肌细胞内获得了成功表达。

关键词：猪圆环病毒2型 ORF2基因增强型绿色荧光蛋白鸭心肌细胞

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犬细小病毒LAMP检测方法的建立

中国预防兽医学报 2010年第7期32卷 550-553页

作者：杨慧曲光刚赵元楷沈志强山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

为提高犬细小病毒(CPV)的检出率,降低检测成本,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立了一种新型敏感、特异、快速、简便、实用的检测CPV的技术。针对CPVVP2基因保守区设计6条引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,并检测其敏感性... 详细信息

为提高犬细小病毒(CPV)的检出率,降低检测成本,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立了一种新型敏感、特异、快速、简便、实用的检测CPV的技术。针对CPVVP2基因保守区设计6条引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化,并检测其敏感性、特异性。所建立的方法最佳反应时间为60min,具有良好的特异性,与同属的其它病毒无交叉反应。该方法对CPV的最低检出量为9.3×10-5ng/μL,其敏感性是PCR的100倍。结果表明,该方法特异性强、敏感性高,并且操作简便、检测成本低,检测时间短,在CPV的综合防治和早期诊断方面具有很高的实用价值。

关键词：犬细小病毒 LAMP 检测方法

杂交猪IL-2和IL-6全基因克隆及序列分析

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黑龙江畜牧兽医 2009年第10期 23-25页

作者：沈志强汪明赵德明王金良唐娜曲光刚中国农业大学动物医学院北京100094 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

为研究杂交猪白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素6(IL-6)在机体免疫应答中的作用,将杂交猪外周血淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下进行体外培养后,提取淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增出杂交猪淋巴细胞IL-2和IL-6的cDNA,克隆到pMD1... 详细信息

为研究杂交猪白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素6(IL-6)在机体免疫应答中的作用,将杂交猪外周血淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下进行体外培养后,提取淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR技术扩增出杂交猪淋巴细胞IL-2和IL-6的cDNA,克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明:杂交猪IL-2基因核苷酸序列与参考序列的同源性为100%;IL-6基因核苷酸序列与GenBank登录的参考序列的核苷酸同源性在99.8%～100%之间,推导氨基酸同源性在99.1%～100%之间。

关键词：白细胞介素2 白细胞介素6 基因克隆序列分析杂交猪

Ⅰ型鸭肝炎病毒SYBR-Green实时荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医学报 2014年第8期34卷 1248-1252页

作者：王文秀张倩曲光刚莫玲沈志强山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80(DQ864514.3)的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重... 详细信息

为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80(DQ864514.3)的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系(R2=0.998 2),产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。

关键词： Ⅰ型鸭肝炎病毒 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR ELISA

某猪场爆发高致病性猪繁殖与呼吸综合征的诊断

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畜牧与兽医 2008年第9期40卷 83-85页

作者：谢金文李峰沈志强任艳玲魏凤唐娜曲光刚山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点实验室山东滨州256600 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600

2007年6月份,某猪场爆发一起以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,临诊症状主要表现为高烧、皮肤发红、怀孕母猪流产,剖检主要特征是间质性肺炎。经过病原分离,获得一株能够引起Marc-145细胞发生病变的病毒。进一步通过血清... 详细信息

2007年6月份,某猪场爆发一起以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,临诊症状主要表现为高烧、皮肤发红、怀孕母猪流产,剖检主要特征是间质性肺炎。经过病原分离,获得一株能够引起Marc-145细胞发生病变的病毒。进一步通过血清中和试验、血凝试验、RT-PCR,确定此次分离的病毒为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。综合该病的流行病学特征、临床症状、剖检病理变化以及实验室检验,确诊该病为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪繁殖与呼吸综合征。

关键词：传染性疾病细胞病变分离高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒

奥氏奥斯特他线虫巨噬细胞转移抑制因子克隆表达与酶功能鉴定

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中国兽医学报 2013年第11期33卷 1679-1684页

作者：曲光刚沈志强王文秀王金良唐娜付石军唐世云韩文瑜吉林大学动物医学学院吉林长春130062 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

通过原核表达系统表达奥氏奥斯特他线虫(Ostertagia ostertagi)巨噬细胞转移抑制因子(OoMIF),并对该蛋白的酶功能进行鉴定。通过GenBank和Nematode V 3.0数据库发表的序列,利用分子生物学软件设计了1对特异的引物,通过RT-PCR扩增OoMIF... 详细信息

通过原核表达系统表达奥氏奥斯特他线虫(Ostertagia ostertagi)巨噬细胞转移抑制因子(OoMIF),并对该蛋白的酶功能进行鉴定。通过GenBank和Nematode V 3.0数据库发表的序列,利用分子生物学软件设计了1对特异的引物,通过RT-PCR扩增OoMIF全基因,经测序分析后,将OoMIF亚克隆到pET28a(+),然后将鉴定为阳性的重组质粒转化到BL21中用IPTG进行诱导表达。利用HPLC对可溶性表达的重组OoMIF蛋白进行纯化,同时通过免疫印迹对线虫自身的MIF及纯化后的OoMIF进行鉴定,最后对OoMIF的互变异构酶和氧化还原酶活性进行鉴定。结果表明OoMIF具有互变异构酶活性,但没有氧化还原酶活性。为进一步探究OoMIF生物学功能及其MIF在宿主免疫调节中的作用提供依据。

关键词：线虫巨噬细胞转移抑制因子免疫印迹氧化还原酶互变异构酶

IBRVgB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医学报 2012年第12期32卷 1787-1791页

作者：曲光刚王金良郭广君唐娜谢金文代长春沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 滨州职业学院山东滨州256600

根据GenBank登陆的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer Express 3.0分别设计2对特异引物及其相应的TaqMan探针,优化反应体系后,建立牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。本方法利用10倍稀释的标准品进行扩增... 详细信息

根据GenBank登陆的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer Express 3.0分别设计2对特异引物及其相应的TaqMan探针,优化反应体系后,建立牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。本方法利用10倍稀释的标准品进行扩增确定该方法的灵敏性,通过对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)等检测验证特异性,并进行临床检验。结果显示,建立的IBRV gB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的灵敏度为11个拷贝/μL,而且与PRV等非IBRV无交叉反应。本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确、等优点.可用于IBRV的检测。

关键词：牛传染性鼻气管炎病毒 gB基因实时荧光定量PCR TaqMan探针