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基于不确定度评估研究ID-LC-MS/MS法检测鸡蛋中氟虫腈砜残留量的关键控制点

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浙江农业学报 2024年第3期36卷 643-650页

作者：张巧艳方维焕郑蔚然王夏君刘超纲王强浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所浙江杭州310021 浙江大学动物科学学院浙江杭州310058 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所浙江杭州310021

为了控制检测结果准确性,以鸡蛋粉中氟虫腈砜残留分析标准物质[GBW(E)100779]为测试样,采用“自下而上”法对基于多功能净化柱(PAC柱)净化的同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC-MS/MS)法进行测量不确定度评估。“鱼骨图”分析表明,不确... 详细信息

为了控制检测结果准确性,以鸡蛋粉中氟虫腈砜残留分析标准物质[GBW(E)100779]为测试样,采用“自下而上”法对基于多功能净化柱(PAC柱)净化的同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC-MS/MS)法进行测量不确定度评估。“鱼骨图”分析表明,不确定度分量主要来源有样品称样量、内标溶液添加体积、标准工作溶液浓度及其移取体积。内标溶液添加体积引入的不确定度最大,对检测结果不确定度的贡献率为68.59%;万分之一天平称量引入的不确定度可忽略不计。同位素内标的添加过程是ID-LC-MS/MS法检测的关键控制点,参考基准的合理选择和目标物的完全提取是准确测量的前提。进一步用LC-MS/MS法对参考物质、稀释剂和内标溶液的适用性进行了评估,并基于国家有证标准物质[GBW(E)100779]对提取方法进行了优化。研究结果有利于提升鸡蛋食品安全的检测质量和质控水平,为精准检测质控方案的设计提供新思路。

关键词：测量不确定度鸡蛋氟虫腈砜同位素稀释液相色谱串联质谱法(ID-LC-MS/MS) 质量控制标准物质

基于体外自连接的猪圆环病毒2型感染性克隆构建方法

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生物工程学报 2024年第7期40卷 2333-2345页

作者：孙仁杰杨永乐王雅婷谢荣辉张传亮方维焕李肖梁赵灵燕浙江省动物疫病预防控制中心浙江杭州311199 湘湖实验室浙江杭州311231 浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室浙江杭州310058

本研究旨在建立一种快速构建猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)感染性克隆的方法。以临床分离的PCV2 LX株为模板,利用DNA无缝克隆技术成功构建了PCV2环状感染性克隆。同时,在基因组体外自连接的构建过程以及拯救病毒的生... 详细信息

本研究旨在建立一种快速构建猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)感染性克隆的方法。以临床分离的PCV2 LX株为模板,利用DNA无缝克隆技术成功构建了PCV2环状感染性克隆。同时,在基因组体外自连接的构建过程以及拯救病毒的生长特性上,将本方法与常规酶切连接方法进行了比较。本方法无须分析和引入限制性内切酶位点,避免了传统酶切连接的繁琐,能更高效地进行PCV2基因组的编辑。构建的感染性克隆经脂质体转染细胞,成功拯救获得可以稳定传代的重组病毒,并且重组病毒在PK-15细胞和3D4/31细胞(猪肺泡巨噬细胞系)上具有更强的增殖能力。综上所述,本研究构建了一种基于体外自连接的PCV2反向遗传操作系统,为PCV2基因工程疫苗的研发提供新策略,为其他新发圆环病毒(PCV3和PCV4)感染性克隆的构建提供借鉴。

关键词：猪圆环病毒2型感染性克隆体外自连接病毒拯救

减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达新城疫病毒融合蛋白

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第4期34卷 488-493页

作者：方维焕梁雪芽浙江大学动物预防医学研究所杭州310029 浙江大学动物预防医学研究所

RT PCR扩增了新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株的融合蛋白 (F)基因并插入到 pcDNA3的CMV启动子下游 ,构建成真核表达质粒pcDNA3 F ,高压电转化dam和 phoP基因双突变株减毒鼠伤寒沙门氏菌 (ZJ111株 ) ,并直接感染Vero细胞 ,分别提取细胞总DNA和... 详细信息

RT PCR扩增了新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株的融合蛋白 (F)基因并插入到 pcDNA3的CMV启动子下游 ,构建成真核表达质粒pcDNA3 F ,高压电转化dam和 phoP基因双突变株减毒鼠伤寒沙门氏菌 (ZJ111株 ) ,并直接感染Vero细胞 ,分别提取细胞总DNA和总RNA ,DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行间接免疫荧光试验 ,可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测F蛋白结果表明 ,转染后 4 8h开始表达 ,随后逐渐增多。SDS PAGE和Western印迹可检测到 5 5kD的蛋白质条带。上述试验结果证实减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给Vero细胞 ,而且还得到了转录和表达 ,表达的F蛋白具有免疫反应性 ,为研制减毒沙门氏菌为载体的口服NDVDNA疫苗创造了条件。

关键词：新城疫病毒(NDV) 融合蛋白(F) 减毒沙门氏菌 DNA疫苗载体

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基于光激活定位显微镜的膜蛋白鉴定技术

生物工程学报 2012年第11期28卷 1378-1387页

作者：黄丽方维焕俞盈宋厚辉浙江农林大学动物科技学院浙江临安311300 浙江大学动物预防医学研究所浙江省动物预防医学重点实验室浙江杭州310058

病原菌膜蛋白的原位标记和定位追踪是一项非常繁琐的工作。为了建立一种可以用于快速鉴定膜蛋白、且分辨率达到纳米级别的膜蛋白荧光定位技术,将结核分枝杆菌外膜蛋白OmpA与具有光敏活性的蛋白mEos2m在无致病性的耻垢分枝杆菌中进行融... 详细信息

病原菌膜蛋白的原位标记和定位追踪是一项非常繁琐的工作。为了建立一种可以用于快速鉴定膜蛋白、且分辨率达到纳米级别的膜蛋白荧光定位技术,将结核分枝杆菌外膜蛋白OmpA与具有光敏活性的蛋白mEos2m在无致病性的耻垢分枝杆菌中进行融合表达。重组菌固定在载玻片上后,利用405 nm激光激活mEos2m。利用普通荧光体视显微镜、正置荧光显微镜和超分辨率光激活定位显微镜观察OmpA-mEos2m,分析融合蛋白在细菌内的分布情况,并捕获光激活蛋白在细胞膜上释放的光子信号。通过超分辨率光激活定位显微镜,发现OmpA-mEos2m融合蛋白在细胞膜上呈"带"状环绕分布,这是观察到膜蛋白在细胞膜上定位的最直接证据。mEos2m与OmpA融合表达后,并不改变OmpA的膜蛋白属性和定位特征。因此可以将mEos2m用于其他非多聚体膜蛋白的融合和定位研究。可以应用非致病性的耻垢分枝杆菌作为模型,采用高分辨率活菌成像技术,研究致病性的结核分枝杆菌蛋白结构、定位和功能。这是目前为止国内采用光激活定位显微成像技术研究膜蛋白的首次报道。

关键词：光激活定位显微镜结核分枝杆菌膜蛋白光子

表达绿色荧光蛋白重组单核细胞增多性李斯特菌的构建(英文)

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2005年第5期31卷 638-644页

作者：柯春林宋厚辉江玲丽张桂芝方维焕浙江大学动物预防医学研究所浙江省动物预防医学重点实验室浙江杭州310029 中国科学院微生物研究所北京100080

将编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因融合到单核细胞增多性李斯特菌actA基因启动子和信号肽下游,应用同源重组技术构建了含gfp的重组李斯特菌突变株.PCR扩增及其产物的酶切鉴定均证实目的基因gfp融合到李斯特菌基因组中.荧光显微镜下可见重... 详细信息

将编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因融合到单核细胞增多性李斯特菌actA基因启动子和信号肽下游,应用同源重组技术构建了含gfp的重组李斯特菌突变株.PCR扩增及其产物的酶切鉴定均证实目的基因gfp融合到李斯特菌基因组中.荧光显微镜下可见重组菌体发绿色荧光.SDS-PAGE电泳和免疫印迹结果显示重组李斯特菌表达的GFP分子量约为28 kD,与预计的分子量大小一致.重组菌对鸡胚和小鼠的毒力以及对体外培养细胞的侵袭力均低于野生型李斯特菌.该重组菌可用于研究李斯特菌的致病机理和食品加工过程中微生物污染控制的指示性细菌.

关键词：单核细胞增多性李斯特菌同源重组绿色荧光蛋白外源基因表达

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虾仁中副溶血弧菌灭活动力学模型的建立

微生物学报 2013年第1期53卷 31-37页

作者：刘媛方春程昌勇方维焕浙江大学动物预防医学研究所浙江省动物医学重点实验室杭州310058

【目的】建立醋酸、乳酸和柠檬酸对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)在生理盐水和虾仁中的灭活动力学模型,指导有机酸应用于虾仁加工过程中的抑菌保鲜。【方法】测定副溶血弧菌在生理盐水和新鲜虾仁中经不同浓度有机酸溶液浸泡处理1... 详细信息

【目的】建立醋酸、乳酸和柠檬酸对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)在生理盐水和虾仁中的灭活动力学模型,指导有机酸应用于虾仁加工过程中的抑菌保鲜。【方法】测定副溶血弧菌在生理盐水和新鲜虾仁中经不同浓度有机酸溶液浸泡处理10min后的存活率P,虾仁中的细菌存活率与有机酸浓度呈良好的线性关系;生理盐水中的存活率通过ln[P/(1-P)]转换成logit(P),与有机酸浓度之间的线性拟合度显著提高。通过拟合方程计算有机酸的50%和90%有效抑菌浓度(EC50和EC90),比较不同有机酸的抑菌能力以及在不同基质中的作用差异。【结果】副溶血弧菌在生理盐水中对有机酸较为敏感,在虾仁中的杀菌效果相对较差,虾仁中乳酸与柠檬酸的有效抑菌浓度(EC50或EC90)是生理盐水中浓度的160-200倍,醋酸的浓度比其在生理盐水中的浓度高出70倍以上,表明食品基质对有机酸的抑菌作用有显著影响,但采用的有机酸在虾仁中的EC90并未超过美国农业部规定的2.5%上限。以有机酸的总摩尔浓度比较,柠檬酸的抑菌能力最强,乳酸次之,醋酸最弱。【结论】抑菌剂效应呈非线性时,细菌存活率进行对数转换,可显著提高线性拟合度R2;食品基质对有机酸的抑菌作用有明显影响;应用浓度为2%的3种有机酸可以有效降低水产品中弧菌的污染量,提高产品的卫生质量。

关键词：虾仁副溶血弧菌有机酸灭活动力学

猪链球菌血清2型JX02株溶血素基因的克隆及序列分析

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中国兽医学报 2003年第5期23卷 460-462页

作者：马有智方维焕浙江大学动物预防医学研究所浙江杭州310029

采用特异性引物对猪链球菌 2型 (Streptococcus suistype 2 ) JX0 2菌株进行 PCR扩增 ,将扩增到的溶血素基因克隆到 p MD18- T质粒载体中 ,经鉴定后测序。结果显示 ,扩增的 JX0 2株溶血素基因长度为 14 94 bp,与 P1/ 7株和 U S-1933株... 详细信息

采用特异性引物对猪链球菌 2型 (Streptococcus suistype 2 ) JX0 2菌株进行 PCR扩增 ,将扩增到的溶血素基因克隆到 p MD18- T质粒载体中 ,经鉴定后测序。结果显示 ,扩增的 JX0 2株溶血素基因长度为 14 94 bp,与 P1/ 7株和 U S-1933株等进行序列比较 ,核苷酸同源性为 10 0 %和 99.7% ,氨基酸序列同源性为 10 0 %和 99.8%。

关键词：猪链球菌血清2型 JX02株溶血素基因基因克隆序列分析毒力因子保护性抗原

副溶血弧菌VPA1045和VPA1049调节Hcp2蛋白转位

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微生物学报 2012年第8期52卷 954-961页

作者：俞盈张晏李俊杨虹宋厚辉方维焕浙江大学动物预防医学研究所浙江省动物预防医学重点实验室杭州310058 浙江农林大学动物科技学院杭州311300

【目的】副溶血弧菌通过分泌多种毒力因子引起急性胃肠炎,其中Ⅵ型分泌系统(T6SS1和T6SS2)是近年来新发现的一种毒力因子分泌系统,但该系统如何受到调控的、如何影响细胞粘附等问题在副溶血弧菌中尚不清楚。本研究的目的是为了阐明副溶... 详细信息

【目的】副溶血弧菌通过分泌多种毒力因子引起急性胃肠炎,其中Ⅵ型分泌系统(T6SS1和T6SS2)是近年来新发现的一种毒力因子分泌系统,但该系统如何受到调控的、如何影响细胞粘附等问题在副溶血弧菌中尚不清楚。本研究的目的是为了阐明副溶血弧菌调控因子VPA1045和VPA1049对T6SS2分泌系统在转录、翻译和翻译后水平的调控作用。【方法】利用同源重组方法构建Vpa1045和Vpa1049缺失株,荧光定量方法检测T6SS2转位因子hcp2的转录水平差异,免疫印迹分析细菌菌体中Hcp2的表达与上清中Hcp2的跨膜转位差异。【结果】副溶血弧菌VPA1045和VPA1049的基因结构中均含有Che-Y结构域,属于二元调控因子的反应调节因子。缺失Vpa1045和Vpa1049后,菌体中的Hcp2表达量和基因组中hcp2的转录水平差异不显著,细菌上清中的Hcp2转位量和对HeLa细胞的细胞粘附率与亲本株HZ相比显著下降。【结论】二元调控因子VPA1045和VPA1049通过上调Hcp2的转位量从而翻译后上调副溶血弧菌T6SS2。

关键词：副溶血弧菌 Ⅵ型分泌系统二元调控因子

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几种中草药对中性白细胞吞噬功能的影响

中兽医学杂志 1991年第1期 5-7页

作者：方维焕浙江衣业大学

中草药治疗细菌感染性疾病,除了药物的抗菌作用以外,对机体非特异性免疫功能的调节作用也是一个很重要的方面。蒲公英、紫花地丁以及金银花等清热解毒中草药经常用于乳旁炎的治疗,据报道蜂胶注射液治疗乳房炎有效。但体外抑菌试验表明。

关键词：中草药白细胞吞噬功能