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RAS/ERK和PI3K/Akt串线信号网络的敏感性分析研究

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四川大学学报（自然科学版） 2012年第5期49卷 1149-1153页

作者：董珂文艳君四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室成都610041

建立了一个包含RAS/ERK(extracellular signal-regulated kinase)和PI3K/Akt信号通路的生化反应网络,采用基于LHS(Latin Hypercube sampling)抽样的多参数敏感性分析方法计算了网络参数变化对于ERK活化的影响,分析了PI3K/Akt信号通路的引入对RAS/ERK信号通路敏感性分布的影响.研究结果表明,K14,K17,K21,Km23,V26,Km27,K29',K31,K33',K37',K42',Kcat43,K46'Km52,K52'等是ERK信号的敏感参数.与此前单独的ERK通路参数敏感性研究结果相比,发现了在Ras上游有敏感性参数存在,能够为抑制ERK,PI3K/Akt联合通路提供新的靶点寻找策略.

关键词：系统生物学 RAS/ERK PI3K/Akt 串线多参数敏感分析

小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子真核表达载体pSecTag2B-msBlyS的构建

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华西口腔医学杂志 2004年第2期22卷 145-148页

作者：傅春华田聆魏于全文艳君李炯四川大学教育部口腔生物医学工程教育部重点实验室四川成都610041 四川大学华西医院人类疾病生物治疗教育部重点实验室与肿瘤中心四川成都610041

目的　克隆BALB c小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子 (msBlyS)的cDNA片段并测序分析 ,为研究msBlyS诱导的抗肿瘤作用提供目的基因。方法　采用反转录聚合酶联反应 (RT_PCR)法从BALB c小鼠脾脏组织总RNA中获得 5 6 6bp的msBlyS基因cDNA。通过T... 详细信息

目的　克隆BALB c小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子 (msBlyS)的cDNA片段并测序分析 ,为研究msBlyS诱导的抗肿瘤作用提供目的基因。方法　采用反转录聚合酶联反应 (RT_PCR)法从BALB c小鼠脾脏组织总RNA中获得 5 6 6bp的msBlyS基因cDNA。通过TA克隆测序无误 ,再将其定向连接到pSecTag2B真核表达载体上 ,转化E .coliXL1_blue。限制性内切酶筛选出阳性克隆pSecTag2B_msBlyS ,末端终止法完成msBlyScDNA的序列测定。结果　测得的msBlyScDNA序列与基因文库中报道序列完全相同 ,插入相位正确 ,未改变目的基因的阅读框架。结论　成功克隆了小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子基因 ,为研究其诱导的抗肿瘤作用奠定了基础。

关键词：小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子真核表达载体 pSecTag2B-msBlyS 抗体基因片段

转染小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子稳定表达细胞株的筛选与鉴定

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生物医学工程学杂志 2004年第6期21卷 897-900页

作者：傅春华田聆魏于全阚兵李炯文艳君四川大学华西医院人类疾病生物治疗教育部重点实验室与肿瘤中心

用脂质体包裹纯化的小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子 (msBlyS)重组表达质粒 ,体外转染小鼠结肠癌细胞系CT2 6 ,通过Zeosin抗性筛选获得抗性的单克隆肿瘤细胞株。提取细胞总RNA做半定量RT PCR ,鉴定出高表达msBlyS的稳定细胞克隆 ,进一步做W... 详细信息

用脂质体包裹纯化的小鼠可溶性B淋巴细胞刺激因子 (msBlyS)重组表达质粒 ,体外转染小鼠结肠癌细胞系CT2 6 ,通过Zeosin抗性筛选获得抗性的单克隆肿瘤细胞株。提取细胞总RNA做半定量RT PCR ,鉴定出高表达msBlyS的稳定细胞克隆 ,进一步做Western blotting鉴定和生物活性测定。转染后得到 8个单克隆抗性肿瘤细胞株 ,其中有 5个经RT PCR扩增出msBlyS目的条带。Western blotting显示该克隆株细胞裂解物可与抗msBlyS的抗体结合 ,在杂交膜上形成一条与预期蛋白分子量一致的条带。生物活性测定显示细胞分泌上清可共刺激(Costimulate)体外培养的B淋巴细胞增殖 ,这表明已成功转染并筛选出msBlyS稳定表达小鼠结肠癌细胞株 ,可以进一步用于msBlyS抗肿瘤作用的观察和研究。

关键词：小鼠体外转染 B淋巴细胞刺激因子稳定表达肿瘤细胞株 Western-blotting 单克隆蛋白分子细胞裂解重组表达质粒

异种同源表皮生长因子受体EGFR胞外段在毕赤巴斯德酵母中的表达

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四川大学学报（医学版） 2005年第2期36卷 153-156页

作者：方芳李炯文艳君田聆魏于全四川大学华西医院人类疾病生物治疗教育部重点实验室肿瘤中心成都610041

目的　实现异种同源表皮生长因子受体 EGFR胞外段在毕赤巴斯德酵母中的分泌性表达。方法　将鼠和人的 EGFR胞外段目的基因 (mer,her)与分泌型毕赤酵母表达载体 p PICZa A重组 ,构建了相应的重组表达质粒 p PICZa A- mer和 p PICZa A- h... 详细信息

目的　实现异种同源表皮生长因子受体 EGFR胞外段在毕赤巴斯德酵母中的分泌性表达。方法　将鼠和人的 EGFR胞外段目的基因 (mer,her)与分泌型毕赤酵母表达载体 p PICZa A重组 ,构建了相应的重组表达质粒 p PICZa A- mer和 p PICZa A- her,用 Sac 将重组质粒线性化后 ,电穿孔转化酵母菌株 GS115 ,利用 Zeocin筛选阳性克隆 ,挑出阳性克隆用甲醇小规模诱导表达后 ,进行 SDS- PAGE分析及 Western- blot检测 ,筛选高表达量的克隆作大规模诱导表达。结果　获得了鼠和人的 EGFR胞外段目的蛋白在毕赤巴斯德酵母中的分泌性表达 ,SDS-PAGE分析及 Western- blot检测得到预期条带 ,相对分子质量约为 95× 10 3。免疫印迹分析表明 ,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论　 p PICZa A- mer和 p PICZa A- her重组质粒在甲醇营养型酵母中可经甲醇诱导表达鼠和人的 EGFR胞外段目的蛋白。

关键词：表皮生长因子受体胞外段毕赤巴斯德分泌表达

HBx和mIL-12双基因重组腺病毒的构建

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四川大学学报（医学版） 2010年第6期41卷 936-940页

作者：李亚欧陈平李志勇文艳君四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室成都610064 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室成都610041

目的构建携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12。方法采用酶切、连接的方法分别将基因HBx和mIL-12连接到穿梭质粒载体pAdenoVator-CMV5。将构建正确的穿梭质粒pAdV-HBx-mIL-12经EcoRⅠ酶切线性化后,转化于含腺病毒骨架质粒pA... 详细信息

目的构建携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12。方法采用酶切、连接的方法分别将基因HBx和mIL-12连接到穿梭质粒载体pAdenoVator-CMV5。将构建正确的穿梭质粒pAdV-HBx-mIL-12经EcoRⅠ酶切线性化后,转化于含腺病毒骨架质粒pAdenoVatorΔE1/E3的BJ5183感受态细菌,实现细菌内同源重组。将鉴定正确的重组腺病毒质粒pAd-HBx-mIL-12经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞,包装并扩增获得携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12。结果经鉴定携带HBx和mIL-12双基因的重组腺病毒构建成功,并可在293细胞中有效表达。结论成功构建了携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12,为探讨其联合抗肿瘤机制及后续基因治疗奠定了基础。

关键词： HBx mIL-12重组腺病毒基因治疗

hPNAS-4腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤作用

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四川大学学报（自然科学版） 2009年第5期46卷 1537-1542页

作者：倪睿严飞袁铸李炯文艳君四川大学生命科学学院成都610064 四川大学华西医院人类疾病生物治疗国家重点实验室成都610041

用RT-PCR从A293细胞中克隆hPNAS-4编码区cDNA,将其酶切后连接至pEN-TRll载体上,再通过同源重组作用将hPNAS-4基因片段重组至腺病毒骨架载体上,构建腺病毒重组质粒,最后经293细胞的包装扩增后得到携带hPNAS-4基因的重组腺病毒;将重组腺... 详细信息

用RT-PCR从A293细胞中克隆hPNAS-4编码区cDNA,将其酶切后连接至pEN-TRll载体上,再通过同源重组作用将hPNAS-4基因片段重组至腺病毒骨架载体上,构建腺病毒重组质粒,最后经293细胞的包装扩增后得到携带hPNAS-4基因的重组腺病毒;将重组腺病毒体外感染人肺癌A549细胞;RT-PCR测得感染细胞中hPNAs-4表达明显上调,MTT测得细胞增殖受到明显抑制,流式细胞仪测得细胞凋亡率明显升高,琼脂糖凝胶电泳显示其基因组DNA有明显的梯状条带.以上结果表明hPNAS-4过表达对A549肿瘤细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用.

关键词： PNAS-4 基因治疗腺病毒肿瘤凋亡

肝片吸虫DNA疫苗的构建及其免疫效应的初步研究

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四川大学学报（自然科学版） 2000年第1期37卷 110-114页

作者：文艳君徐恒高继魁四川大学生命科学学院成都610064

用ＥｃｏＲＩ酶切含肝片吸虫保护性抗原基因ＦＨ３的重组质粒ｐＵＣ１８／ＦＨ３，回收ＦＨ３（～１．０Ｋｂ）片段克隆到真核表达载体ｐＢｌｕｅＣＭＶ上，酶切筛选顺向插入重组子ｐＢｌｕｅＣＭＶ－ＦＨ３，即得到一种肝片吸虫ＤＮ... 详细信息

用ＥｃｏＲＩ酶切含肝片吸虫保护性抗原基因ＦＨ３的重组质粒ｐＵＣ１８／ＦＨ３，回收ＦＨ３（～１．０Ｋｂ）片段克隆到真核表达载体ｐＢｌｕｅＣＭＶ上，酶切筛选顺向插入重组子ｐＢｌｕｅＣＭＶ－ＦＨ３，即得到一种肝片吸虫ＤＮＡ疫苗．制备纯化该疫苗并免疫小鼠，小鼠肌肉细胞中有一定的ＦＨ３抗原表达；用ＥＬＩＳＡ检测抗血清表明，注射疫苗的小鼠均伴随产生一定量的特异性抗体．用肝片吸虫囊蚴攻击（２０囊／鼠）小鼠，初步显示有一定的减虫率．

关键词：肝片吸虫 DNA疫苗免疫效应寄生虫病

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小鼠B细胞趋化因子原核表达与纯化

生物医学工程学杂志 2004年第2期21卷 251-254页

作者：姜愚文艳君刘继彦邹春华田聆魏于全四川大学华西医院人类疾病生物治疗教育部重点实验室肿瘤中心成都610041

用多聚酶链反应 (PCR)扩增小鼠 B细胞趋化因子 (BL C)基因片断并导入 Bam H1和 Pst1两个酶切位点 ,插入到原核表达载体 PQE30中 ,构建重组质粒 p BL C- PQE30 ,并诱导相对分子量为 10 Kda的重组目的蛋白r BL C的表达 ,通过 Ni柱亲和层... 详细信息

用多聚酶链反应 (PCR)扩增小鼠 B细胞趋化因子 (BL C)基因片断并导入 Bam H1和 Pst1两个酶切位点 ,插入到原核表达载体 PQE30中 ,构建重组质粒 p BL C- PQE30 ,并诱导相对分子量为 10 Kda的重组目的蛋白r BL C的表达 ,通过 Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。双酶切和测序分析显示小鼠 B细胞趋化因子片断正确插入原核表达载体 PQE30中 ,重组蛋白 Western blot分析显示出特异性条带。提示已通过基因工程方法获得并纯化了小鼠B细胞趋化因子重组蛋白。

关键词：小鼠 B细胞趋化因子原核表达多聚酶链反应 PCR BLC 重组蛋白

人alpha防御素1真核表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

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郑州大学学报（医学版） 2008年第2期43卷 248-252页

作者：徐宁王永生文艳君生物治疗国家重点实验室四川大学华西医院肿瘤中心成都610041

目的:观察重组人alpha防御素1(HNP1)真核表达质粒对体外培养人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法:从人外周血白细胞中提取总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到人HNP1成熟肽基因片断。构建pSecTag-HNP1重组质粒,转染A549细胞,并设... 详细信息

目的:观察重组人alpha防御素1(HNP1)真核表达质粒对体外培养人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法:从人外周血白细胞中提取总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到人HNP1成熟肽基因片断。构建pSecTag-HNP1重组质粒,转染A549细胞,并设pSecTag转染组、脂质体转染组和未转染组作为对照。RT-PCR验证HNP1的表达,MTT法检测肿瘤细胞的生长情况,流式细胞仪及PI染色检测细胞凋亡情况。结果:构建了重组质粒pSecTag-HNP1,测序正确。转染A549细胞后,RT-PCR成功扩增出HNP1片断。与其他3组相比,HNP1转染A549细胞48h后细胞的生存率降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。流式细胞仪及PI染色结果显示pSecTag-HNP1转染后的细胞凋亡增多(P<0.05)。结论:转染pSecTag-HNP1后,重组HNP1能够在A549细胞中表达并有效地抑制A549细胞的增殖,促进细胞凋亡。

关键词：人alpha防御素1 A549细胞细胞凋亡