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一种水相反应制备胰岛素衍生物的方法

中国现代医学杂志 2009年第7期19卷 1028-1030页

作者：惠长野南方医科大学微生物系广东广州510515

目的建立一种简易的制备去B30及去B23-30肽胰岛素的方法。方法在转肽方法基础上,改变胰蛋白酶反应条件,在水相反应系统中,使得小C肽猪胰岛素原生成去B30及去B23-30肽胰岛素。阴离子交换层析进行产物分离,并结合HPLC纯度分析及质谱鉴定... 详细信息

目的建立一种简易的制备去B30及去B23-30肽胰岛素的方法。方法在转肽方法基础上,改变胰蛋白酶反应条件,在水相反应系统中,使得小C肽猪胰岛素原生成去B30及去B23-30肽胰岛素。阴离子交换层析进行产物分离,并结合HPLC纯度分析及质谱鉴定。结果胰蛋白酶催化猪胰岛素原生成去B30及去B23-30肽胰岛素。离子交换层析可以对两者进行基线分离。结论成功建立了一种制备胰岛素衍生物的方法,并对产物进行有效纯化。

关键词：转肽去B30胰岛素去B23-30肽胰岛素

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东亚钳蝎抗神经兴奋肽表达、纯化及部分性质

东亚钳蝎抗神经兴奋肽表达、纯化及部分性质

作者：惠长野沈阳药科大学

学位级别：硕士

对东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)同源性分析表明：ANEP与蝎昆虫抑制性神经毒素高度同源，ANEP应属于这一家庭，它们都作用于钠离子通道，是钠离子通道抑制剂。蛋白质同源建模软件WHAT—IF对ANEP三维结构及二硫键进行预测，ANEP空间结构与... 详细信息

对东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)同源性分析表明：ANEP与蝎昆虫抑制性神经毒素高度同源，ANEP应属于这一家庭，它们都作用于钠离子通道，是钠离子通道抑制剂。蛋白质同源建模软件WHAT—IF对ANEP三维结构及二硫键进行预测，ANEP空间结构与大部分长链蝎神经毒素相似，二硫键的配对高度保守，由一段a螺旋和三段反平行的β片层构成一个紧密的结构核心，三段反平行的β片层形成一个强疏水面，而C端为无规则卷曲，肽链相对比较延伸。ANEP在大肠杆菌内单独表达二硫键不能形成，多肽以包涵体形式存在于胞浆，将编码序列插入pSYPU-1b，营造胞质氧化环境，该多肽得到了高效可溶性表达。利用His tag对重组多肽进行一步镍柱亲合层析，在非变性、变性条件下，通过改变pH及氯化铵等洗脱条件，可得到电泳纯样品。结合多肽空间结构考察了纯化标签在肽链不同末端的纯化效果，表明空间结构对His tag的屏蔽效应显著影响纯化结果，ANEP在C端融合His tag纯化效果最佳，通过优化纯化条件，ANEP一步镍柱可达到电泳纯，每升发酵液可得目的多肽3mg，而N端融合时收率为0.8mg／L。对于用IPTG、乳糖诱导的由T7 lacUV5启动子控制的重组目的产物的表达规律进行了研究。借助SDS-PAGE分析目的多肽表达量并结合菌体生长状况，比较了诱导的起始阶段、所需的诱导物浓度、诱导持续时间等参数对重组产物表达的影响，确立了两种诱导剂的最佳发酵条件。并考察了葡萄糖抑制效应对乳糖诱导作用的影响，葡萄糖抑制效应对本实验所用质粒影响非常显著，只有在对数生长中后期加入乳糖才可以看到目的蛋白的微量表达，而IPTG的诱导效果不受葡萄糖影响。考察本实验重组质粒稳定性表明，该质粒稳定性较好，重组菌较空宿主菌相比并无生长劣势，培养重组菌每12小时转接一次，在有抗性选择性压力情况下，转接20次质粒突变率为0.317‰，多次传代后蛋白表达量并没有明显变化，满足大规模发酵用重组质粒要求。

关键词：抗神经兴奋肽分离纯化表达条件优化

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猪小肠黏膜脱氧核糖核酸的提取及质量研究

沈阳药科大学学报 2013年第1期30卷 63-67页

作者：惠长野邵建华郭妍张文深圳市职业病防治院广东深圳518001 扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225009 中国科学院深圳先进技术研究院广东深圳518054

目的以肠衣生产的副产物肠黏膜为原料,进行大分子DNA的提取,并进行质量研究。方法用酶解-超滤法提取DNA,工艺过程中监控主要组分的分离及终产品质量。结果酶解法释放基因组DNA、肝素,蛋白质被水解为寡肽及氨基酸,DNA被超滤截留,钙盐沉... 详细信息

目的以肠衣生产的副产物肠黏膜为原料,进行大分子DNA的提取,并进行质量研究。方法用酶解-超滤法提取DNA,工艺过程中监控主要组分的分离及终产品质量。结果酶解法释放基因组DNA、肝素,蛋白质被水解为寡肽及氨基酸,DNA被超滤截留,钙盐沉淀法去除大分子肝素。终产品在含量及纯度上达到国外同类产品水平。结论从肠黏膜提取DNA切实可行,对猪小肠综合利用有着重要的现实意义。

关键词：肠黏膜脱氧核糖核酸酶解-超滤法提取

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大肠杆菌K1致病株外膜蛋白T体外功能

微生物学报 2010年第1期50卷 48-53页

作者：惠长野郭妍吴书驰彭亮曹虹黄胜和南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广州510515 中国科学院深圳先进技术研究院深圳518054

纤溶酶原激活及水解抗菌肽利于致病菌侵袭及体内存活。【目的】构建大肠杆菌K1致病株E44的ompT基因缺失突变株,证实E44外膜蛋白T(OmpT)体外激活纤溶酶原及水解抗菌肽鱼精蛋白的活性。【方法】采用基因同源重组技术敲除大肠杆菌K1株E44中... 详细信息

纤溶酶原激活及水解抗菌肽利于致病菌侵袭及体内存活。【目的】构建大肠杆菌K1致病株E44的ompT基因缺失突变株,证实E44外膜蛋白T(OmpT)体外激活纤溶酶原及水解抗菌肽鱼精蛋白的活性。【方法】采用基因同源重组技术敲除大肠杆菌K1株E44中的ompT基因,构建ompT缺失突变株;二步柱层析纯化E44外膜组分,S-2251发色底物法测定其纤溶酶原激活活性;考察野生株E44、ompT基因敲除株E44ompT及转化带有ompT完整阅读框的质粒pUCT的E44ompT/pUCT三者对0.1mg/mL阳离子抗菌肽鱼精蛋白的敏感程度。【结果】利用自杀性载体pCVD442和同源重组的原理构建E44的ompT基因敲除株E44ompT;纯化得到约37kDa的E44外膜组分,S-2251发色底物法证实其具有纤溶酶原激活活性,纤溶酶原激活与膜组分的加入量呈一定量效关系;与野生株E44相比,ompT敲除株E44ompT对0.1mg/mL鱼精蛋白敏感,转化入带有ompT完整序列的质粒pUCT有一定的回补作用,E44ompT部分恢复抗鱼精蛋白能力。【结论】外膜蛋白T在致病株E44中有表达,并具有激活纤溶酶原及水解鱼精蛋白的活性。

关键词：外膜蛋白T 纤溶酶原激活鱼精蛋白水解

肠上皮细胞中大肠杆菌侵袭素IbeA结合蛋白的分离

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南方医科大学学报 2009年第12期29卷 2375-2378页

作者：惠长野郭妍李珺郝小燕曹虹黄胜和南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广东广州510515 中国科学院深圳先进技术研究院广东深圳518054

目的分离肠上皮Caco-2细胞中与IbeA相互作用的蛋白。方法表达并纯化重组IbeA,将1、5、10μg/ml的His-IbeA及牛血清白蛋白与Caco-2单层细胞4℃孵育30min后,在37℃利用庆大霉素保护实验测定各组大肠杆菌K1致病株E44侵袭率的变化。裂解Cac... 详细信息

目的分离肠上皮Caco-2细胞中与IbeA相互作用的蛋白。方法表达并纯化重组IbeA,将1、5、10μg/ml的His-IbeA及牛血清白蛋白与Caco-2单层细胞4℃孵育30min后,在37℃利用庆大霉素保护实验测定各组大肠杆菌K1致病株E44侵袭率的变化。裂解Caco-2得全细胞蛋白,上样至结合有His-IbeA的金属离子螯和柱,His pull down纯化特异性结合蛋白,电泳分析,Far-Western blotting进行两者结合特异性的验证,并分析结合蛋白N末端氨基酸序列。结果重组IbeA阻断E44侵袭Caco-2,并呈一定剂量依赖关系,对照组BSA对侵袭没有显著影响。His pull down的方法纯化出两个结合条带,Far-Western blotting验证了结合的特异性。并测定强结合条带pI约5.0,N端序列为MASITKLP。结论分离得到两个与IbeA相互作用的蛋白,为研究IbeA分子致病机制奠定了基础。

关键词： Caco-2细胞 IbeA蛋白侵袭结合蛋白纯化

shRNA表达载体构建及其对HBV体外抑制作用

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中国公共卫生 2010年第7期26卷 860-862页

作者：彭亮刘志华钟诚丁振华惠长野曹虹南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广州510515 南方医院感染内科南方医科大学公共卫生与热带医学学院防原医学系

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)基因X区和P区的shRNA表达载体,通过纳米聚合物将其转入HBV感染的细胞模型,并检测其对HBV复制的抑制作用。方法设计3条针对HBV基因编码区的干扰RNA序列,合成3对64nt的寡核苷酸,插入载体pRNAT-U6,构建重组干扰质... 详细信息

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)基因X区和P区的shRNA表达载体,通过纳米聚合物将其转入HBV感染的细胞模型,并检测其对HBV复制的抑制作用。方法设计3条针对HBV基因编码区的干扰RNA序列,合成3对64nt的寡核苷酸,插入载体pRNAT-U6,构建重组干扰质粒Sl、S2和S3,利用纳米转染剂转入HBV感染的HepG2细胞。用实时荧光定量法检测HBVmRNA含量。结果干扰质粒S1、S2对HBv的复制有明显抑制作用,荧光定量检测转染后HBVmRNA表达水平发现,HBVmRNA含量分别减少至空白对照组的70.2%和61.2%,无关对照质粒则无抑制作用。结论成功构建针对HBv编码区的shRNA表达载体,并能在体外有效抑制HBVmRNA。

关键词： RNA干扰乙型肝炎病毒纳米聚合物

采用Excel软件拟合辐射生物剂量-效应曲线的方法初探

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职业卫生与应急救援 2023年第1期41卷 108-112,126页

作者：高朝贤杨学琴李丽梅张文冯文艇易娟惠长野深圳市职业病防治院广东深圳518020

目的探讨采用Excel软件拟合辐射生物剂量-效应曲线的方法。方法基于最小二乘法和最大似然法的原理,在Excel中建立数据输入的方法,设计数据处理的公式,用最小二乘法函数拟合4种常用的辐射生物剂量-效应曲线,用最大似然法拟合二次多项式曲... 详细信息

目的探讨采用Excel软件拟合辐射生物剂量-效应曲线的方法。方法基于最小二乘法和最大似然法的原理,在Excel中建立数据输入的方法,设计数据处理的公式,用最小二乘法函数拟合4种常用的辐射生物剂量-效应曲线,用最大似然法拟合二次多项式曲线,并分别与SPSS软件和CABAS软件拟合曲线比较;用Excel拟合曲线的方法验证教材和权威学术期刊中剂量-效应曲线拟合的示例,比较最小二乘法和最大似然法拟合的二次多项式曲线在剂量估算模拟应用上的差异。结果用Excel设计的最小二乘法拟合出4种常用的辐射生物剂量-效应曲线,其参数与SPSS软件拟合的曲线一致,最大似然法拟合的二次多项式与CABAS软件拟合的曲线一致;用Excel拟合曲线的方法所得的曲线参数与文献中示例的曲线拟合参数一致。结论Excel软件可用于辐射生物剂量-效应曲线的拟合和建立,方便实验室生物剂量估算,特别适合大批量样品的估算。

关键词：辐射剂量-效应曲线染色体畸变曲线拟合

深圳市2015-2020年放射工作人员上岗前职业健康检查染色体畸变率与微核率分析

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国际放射医学核医学杂志 2022年第8期46卷 471-477页

作者：李丽梅高朝贤惠长野杨学琴陈钰婷沙焱易娟深圳市职业病防治院病理毒理所深圳518020

目的分析深圳市2015—2020年放射工作人员上岗前职业健康检查染色体畸变率与微核率的水平及其分布特征,为加强放射工作人员辐射防护和职业健康管理提供科学依据。方法选取2015—2020年在深圳市职业病防治院接受上岗前职业健康检查的277... 详细信息

目的分析深圳市2015—2020年放射工作人员上岗前职业健康检查染色体畸变率与微核率的水平及其分布特征,为加强放射工作人员辐射防护和职业健康管理提供科学依据。方法选取2015—2020年在深圳市职业病防治院接受上岗前职业健康检查的2777名放射工作人员开展横断面研究,其中男性2210名、女性567名,年龄17~69(27.6±6.8)岁,将受检者按年龄分为5组:17~20岁、21~30岁、31~40岁、41~50岁、51~69岁。采用全血微量培养法制备受检者的淋巴细胞微核和染色体,应用全自动染色体扫描分析系统对每名受检者的100个淋巴细胞染色体中期分裂相进行分析,统计双着丝粒体、着丝粒环和无着丝粒体等染色体畸变类型,比较不同年龄组以及同年龄组不同性别受检者染色体畸变情况和微核情况的差异。计量资料的组间比较采用方差分析;染色体畸变和微核的分布服从泊松分布,采用非参数检验,2组间比较采用Mann-Whitney U检验,多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。受检者年龄与染色体畸变率、微核率的相关性分析采用Spearman秩相关分析。结果2777名受检者的染色体畸变(双着丝粒体+着丝粒环+无着丝粒体)率为(0.072±0.005)%、双着丝粒体+着丝粒环畸变率为(0.016±0.002)%、染色体畸变细胞率为(0.068±0.005)%、微核率为(0.43±0.01)‰、微核细胞率为(0.40±0.01)‰、淋巴细胞转化率为(85.07±3.16)%。各年龄组间染色体畸变率、双着丝粒体+着丝粒环畸变率、染色体畸变细胞率以及各年龄组不同性别受检者的染色体畸变率、染色体畸变细胞率间的差异均无统计学意义(χ^(2)=1.193、0.931、0.691,Z=−0.929~−0.059,均P>0.05)。与17~20岁年龄组相比,其余各年龄组受检者的微核率、微核细胞率均较高,淋巴细胞转化率均较低,且差异均有统计学意义(Z=−6.981~−2.510,F=4.922~52.860,均P<0.05);受检者的微核率和微核细胞率均与年龄呈正相关(r=0.166、0.168,均P<0.001),而淋巴细胞转化率与年龄呈负相关(r=−0.197,P<0.001);21~30岁年龄组、31~40岁年龄组女性受检者的微核率、微核细胞率以及17~20岁年龄组、21~30岁年龄组女性受检者的淋巴细胞转化率均显著高于同年龄组的男性受检者,且差异均有统计学意义(Z=−4.826~−3.516,F=6.947、14.563,均P<0.01)。结论深圳市2015—2020年放射工作人员上岗前职业健康检查染色体畸变率与微核率均未超过国内文献报道的健康人群的本底水平范围,但有随年龄增大而升高的趋势,需加强放射工作人员的辐射防护与职业健康管理。

关键词：体格检查染色体畸变微核,染色体不完整淋巴细胞活化放射工作人员

慢性苯中毒者血清中叶酸和维生素B_(12)水平的研究

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工业卫生与职业病 2013年第6期39卷 350-352页

作者：王佃鹏张艳芳杨祥丽高燕华李智民惠长野深圳市职业病防治院广东深圳518001

目的了解慢性苯中毒者血清中叶酸和维生素B12水平,为慢性苯中毒的防治提供依据。方法采用化学发光分析仪和全自动血细胞分析仪分别对实验组13名慢性苯中毒患者和对照组35名正常对照者血清叶酸和维生素B12含量以及血细胞参数进行测定。... 详细信息

目的了解慢性苯中毒者血清中叶酸和维生素B12水平,为慢性苯中毒的防治提供依据。方法采用化学发光分析仪和全自动血细胞分析仪分别对实验组13名慢性苯中毒患者和对照组35名正常对照者血清叶酸和维生素B12含量以及血细胞参数进行测定。结果实验组血清叶酸的水平(11.9±5.6)nmol/L明显低于对照组(24.2±8.3)nmol/L(P<0.05),试验组血清维生素B12的水平(154.9±57.2)pmol/L明显低于对照组(372.2±110.1)pmol/L(P<0.05),试验组白细胞(3.5±0.4)×109/L明显低于对照组(7.9±1.9)×109/L(P<0.05),试验组血小板(169.5±71.8)×109/L明显低于对照组(228.4±58.4)×109/L(P<0.05),试验组红细胞(3.8±0.9)×1012/L明显低于对照组(5.1±0.8)×1012/L(P<0.05),试验组血红蛋白(108.5±29.1)g/L明显低于对照组(141.5±16.1)g/L(P<0.05),试验组红细胞压积(33.0±8.0)%明显低于对照组(45.0±4.0)%(P<0.05),试验组红细胞分布宽度(46.3±7.7)fl明显高于对照组(38.8±4.8)fl(P<0.05)。结论慢性苯中毒者血清中叶酸和维生素B12水平偏低,在慢性苯中毒的防治过程中应加强该类物质的补充。

关键词：苯中毒叶酸维生素B12