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作者：张霹雲第三军医大学

学位级别：硕士

肝脏作为人体一个重要代谢器官,当其受到不同病因的影响导致的肝细胞受损后,会发生不同类型干细胞介导的肝再生(liver regeneration)。肝干细胞主要分为内源性干细胞和外源性干细胞。其中内源性干细胞主要以卵圆细胞为主;外源性干细胞... 详细信息

肝脏作为人体一个重要代谢器官,当其受到不同病因的影响导致的肝细胞受损后,会发生不同类型干细胞介导的肝再生(liver regeneration)。肝干细胞主要分为内源性干细胞和外源性干细胞。其中内源性干细胞主要以卵圆细胞为主;外源性干细胞主要来源于造血干细胞,间充质干细胞,内皮祖干细胞等。卵圆细胞作为肝脏的成体干细胞在肝脏再生过程中发挥核心作用。肝卵圆细胞是存在于肝内胆管末端赫令管间隙的一类具有多向分化潜能的细胞群,其在正常情况下呈静止状态,当发生各种肝脏的损伤后便刺激其增殖分化,形成成熟的肝脏细胞和胆管上皮细胞,完成肝脏形态学和功能学上的修复。目前,关于卵圆细胞增殖分化的调控机制尚无定论。因此,探索其新的调控机制很有必要。最新研究报道,表观遗传学的DNA去甲基化与干细胞的增殖分化密切相关。其中DNA羟化酶TET1(Ten-eleven translocation1)是催化5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)去甲基化生成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroymethylcytosine,5hmC)的关键因子,其在胚胎干细胞分化过程中具有促进干性基因转录同时抑制分化基因表达的双重作用。即在胚胎干细胞的发育过程中呈下调趋势。但目前TET1调节干细胞自我更新和分化发育的具体机制还在研究之中,尚不明确。因此,本课题分以下几个部分：1.卵圆细胞增殖肝再生动物模型的建立,即成功建立卵圆细胞增殖的动物模型。2.肝卵圆细胞的分离、提取、培养及鉴定。获得大鼠原代卵圆细胞并鉴定其特异性。3.检测TET1在肝再生动物模型中的动态变化。通过不同实验方法检测TET1在肝再生不同时间段的表达变化趋势。4.检测TET1在卵圆细胞株WB-F344向肝细胞样细胞分化过程中的表达变化。通过建立诱导卵圆细胞株WB-F344向肝细胞样细胞分化的培养体系,观察TET1在其基因和蛋白水平的表达变化。通过上述研究,旨在说明：***1在肝再生过程中的明显的动态变化。***1在卵圆细胞分化为肝细胞样细胞过程中明显下调,从而初步证明TET1可能参与了卵圆细胞的增殖与肝再生过程。方法 1.肝再生动物模型建立取重约150-180g SD大鼠,2-AAF10mg/kg·d灌胃4d。第5天行2/3肝切除术,之后继续2-AAF灌胃。肝切除术后第3、6、9、12、15天处死大鼠获取肝脏标本。 2.原代大鼠卵圆细胞的提取及鉴定原位肝灌注联合离体肝灌注法分离大鼠肝脏细胞,再采用Percoll密度梯度离心法提取目的卵圆细胞。鉴定方法包括肝卵圆细胞形态学鉴定,细胞特异性标记物鉴定等。 3.检测TET1在肝再生动物模型中的动态表达变化包括RT-PCR检测TET1在mRNA水平的动态变化,Western blot检测TET1蛋白水平的表达趋势。 4.多种细胞因子联合诱导原代大鼠肝卵圆细胞卵圆细胞株WB-F344向肝细胞样细胞分化根据实验分为二组,原代不加任何细胞因子培养WB-F344为对照组,用SCF20ug/L、HGF10ug/L, EGF10ug/L等细胞因子诱导7天的WB-F344为实验组。 5.检测诱导前后WB-F344细胞表达卵圆细胞和肝细胞特异性蛋白通过细胞免疫荧光技术分别检测诱导前后卵圆细胞特异性抗体OV6,肝细胞特异性抗体ALB和AFP,胆管上皮细胞特异性抗体CK19的蛋白水平表达变化。 6.细胞免疫荧光、Realtime PCR、Western blot检测诱导前后TET1mRNA和蛋白水平表达变化。结果 1.卵圆细胞增殖动物模型的成功建立。第3、6、9、12、15天取出大鼠剩余肝脏标本,可见随着时间的推移大鼠腹部切口逐渐愈合,余肝体积增大,直至15天恢复正常肝脏大小。 2.采用原位肝灌注加离体肝灌注法联合Percoll密度梯度离心法获得的肝卵圆细胞数量1.34×105/mL。提取的目的细胞倒置显微镜下可见呈圆球形,培养24h后呈半贴壁状态。特异性标记物OV6细胞免疫荧光染色阳性,细胞纯度≥80%。 3. RT-PCR、Western blot检测TET1在肝再生模型中的基因和蛋白表达水平。3d组和6d组的TET1基因表达水平较肝切前对照组明显升高(P0.05)。而肝切后的后期(12、15d)TET1的表达下调(P<0.05),与其蛋白水平动态变化趋势相同。 4.卵圆细胞株WB-F344经过SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF10ug/L等细胞因子诱导后,与诱导前相比较,细胞呈长梭形细胞或多角形改变,核质比减少,形态类似于培养状态下肝细胞。 5.卵圆细胞株WB-F344经过SCF20ug/L、HGF10ug/L、EGF lOug/L等细胞因子诱导后,与对照

关键词：肝脏再生卵圆细胞细胞分化 TET1

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5-甲基胞嘧啶羟化酶TET1在肝再生时卵圆细胞向肝细胞分化过程中的作用

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第三军医大学学报 2014年第8期36卷 797-801页

作者：张霹雲王斌王军魏艳玲孙文静吴林罗茜陈东风第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科重庆400042

目的研究5-甲基胞嘧啶羟化酶TET1在肝脏再生时卵圆细胞向肝细胞分化过程中的作用。方法采用SD大鼠2-乙酰氨基芴(2-AAF)灌胃加2/3肝切除法建立肝脏再生模型,胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法提取纯化大鼠原代卵圆细胞,免疫荧光实验... 详细信息

目的研究5-甲基胞嘧啶羟化酶TET1在肝脏再生时卵圆细胞向肝细胞分化过程中的作用。方法采用SD大鼠2-乙酰氨基芴(2-AAF)灌胃加2/3肝切除法建立肝脏再生模型,胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法提取纯化大鼠原代卵圆细胞,免疫荧光实验鉴定卵圆细胞特异性标志物OV6的表达;RT-PCR和Western blot检测肝切后不同时间(3、6、9、12、15 d)TET1 mRNA和蛋白表达变化。培养WB-F344卵圆细胞,SCF 20μg/L、HGF 10μg/L、EGF 10μg/L、地塞米松1.0×10-7mol/L和DMSO 1.5%处理7 d,诱导其向肝细胞样细胞分化(对照细胞不加任何细胞因子)。倒置相差显微镜观察卵圆细胞形态变化,RT-PCR和Western blot检测TET1表达变化。结果①成功建立肝再生动物模型,分离获得大鼠原代卵圆细胞,其OV6阳性率≥80%。②与对照细胞相比,卵圆细胞被诱导分化后,细胞形态由圆形变为梭形。③与对照细胞相比,卵圆细胞被诱导分化后,TET1 mRNA和蛋白水平均显著下降(P<0.01),此时肝细胞特异性标记物ALB表达升高,卵圆细胞分化为肝细胞样细胞。结论 5-甲基胞嘧啶羟化酶TET1可能参与了卵圆细胞增殖和肝再生过程。

关键词：肝脏再生卵圆细胞细胞分化 TET1

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肝脏再生过程中干细胞分化调控机制的研究进展

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肝脏 2012年第8期17卷 599-602页

作者：张霹雲王军陈东风第三军医大学附属野战外科研究所大坪医院消化内科重庆400042

肝干细胞属于专能干细胞，为肝内胆管系统源性具有多分化潜的细胞群。肝干细胞既可以向肝细胞分化，又可以向胆管细胞分化，是肝脏组织再生的“种子细胞”。自体肝干细胞移植不会发生免疫排斥，故肝脏干细胞移植理论上可以成为终末期肝... 详细信息

肝干细胞属于专能干细胞，为肝内胆管系统源性具有多分化潜的细胞群。肝干细胞既可以向肝细胞分化，又可以向胆管细胞分化，是肝脏组织再生的“种子细胞”。自体肝干细胞移植不会发生免疫排斥，故肝脏干细胞移植理论上可以成为终末期肝病细胞治疗的理想来源，有效解决肝脏供体严重缺乏的临床现状。本文就肝干细胞的生物学特性及其在肝脏损伤再生中的作用及调控机制综述如下。

关键词：细胞分化调控机制肝脏供体再生过程肝干细胞移植胆管系统肝细胞分化终末期肝病生物学特性

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肝星状细胞具有向肝细胞样细胞分化的干细胞潜能

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第三军医大学学报 2013年第7期35卷 604-608页

作者：罗茜王斌雷增杰李青李砚熊吉陈潇迪张霹雲魏艳玲王军陈东风第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科重庆400042

目的探讨肝星状细胞是否能体外诱导分化为肝细胞样细胞以及在这过程中某些干细胞标记物的表达和变化。方法采用标准胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法提取并纯化原代大鼠肝星状细胞,免疫荧光鉴定细胞表型;将原代肝星状细胞分为对照... 详细信息

目的探讨肝星状细胞是否能体外诱导分化为肝细胞样细胞以及在这过程中某些干细胞标记物的表达和变化。方法采用标准胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法提取并纯化原代大鼠肝星状细胞,免疫荧光鉴定细胞表型;将原代肝星状细胞分为对照组和实验组进行体外培养,对照组肝星状细胞不加任何细胞因子培养24 h,实验组肝星状细胞加入bFGF 20μg/L、FGF420μg/L、HGF 20μg/L、IL-6 1μg/L细胞因子诱导7 d;倒置相差显微镜下观察诱导细胞形态的变化,Real-time PCR和细胞免疫荧光技术检测肝星状细胞诱导前后肝细胞ALB、AFP mRNA和蛋白的表达情况,以及诱导前后干细胞标记物mRNA和蛋白水平的表达及变化。结果①通过胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法获得的大鼠肝星状细胞,其特异性蛋白Desmin和GFAP表达阳性率≥95%。②实验组大鼠肝星状细胞经过bFGF、FGF4、HGF、IL-6等细胞因子诱导7 d后,与对照组细胞相比细胞形态由星形变为类圆形或多角形,转录水平出现肝细胞特异性标记物ALB的表达(P<0.01)和AFP的表达(P<0.05),同时实验组ALB和AFP蛋白表达呈阳性,而对照组则呈阴性。③实验组大鼠肝星状细胞经过bFGF、FGF4、HGF、IL-6等细胞因子诱导7 d后,与对照组相比干细胞标记物P75NTR转录水平表达下降(P<0.05),CD90、c-kit、sox-2、oct-4等转录水平表达显著下降(P<0.01),并伴有干细胞标记物蛋白水平的表达下调或无表达。结论初步证明肝星状细胞可能具有潜在的干细胞特性,在体外可诱导分化形成肝细胞样细胞,在诱导过程中肝星状细胞的干细胞标记物明显下调。

关键词：肝星状细胞干细胞细胞分离诱导分化

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内镜下胃黏膜肾上腺素注射联合金属钛夹治疗溃疡性上消化道出血效果探讨

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现代消化及介入诊疗 2019年第A1期24卷 1302-1303页

作者：张霹雲彭鹏肖潇周礼万晓强重庆市急救医疗中心(重庆市第四人民医院)消化内科重庆400014

目的:旨在研究内镜下胃黏膜肾上腺素注射联合金属钛夹治疗溃疡性上消化道出血的临床疗效。方法:研究对象来源于2017年9月-2018年9月因溃疡性上消化道出血在本院接受治疗的患者共90例,将所选患者按照治疗措施的差异性进行均匀分组,将采... 详细信息

目的:旨在研究内镜下胃黏膜肾上腺素注射联合金属钛夹治疗溃疡性上消化道出血的临床疗效。方法:研究对象来源于2017年9月-2018年9月因溃疡性上消化道出血在本院接受治疗的患者共90例,将所选患者按照治疗措施的差异性进行均匀分组,将采取常规治疗措施的患者45例作为对照组,另外45例使用内镜下胃黏膜肾上腺素注射联合金属钛夹治疗,对比分析2种治疗措施的临床疗效。结果:对纳入本次研究的溃疡性上消化道出血患者采用不同的治疗措施后,共有58例患者症状改善,其中患者病情得到改善的患者中观察组:对照组=43例:33例,由此观察组患者治疗效果更优;对比观察组与对照组患者相关临床指标看出观察组患者引流液变清时间、大便潜血转阴时间以及住院时间均低于对照组患者,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:对于溃疡性上消化道出血患者使用内镜下胃黏膜肾上腺素注射联合金属钛夹治疗,在有效缓解患者出血症状的作用上,提升了患者的临床治疗效果,值得推广。

关键词：内镜肾上腺素金属钛夹溃疡性上消化道出血

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多烯磷脂酰胆碱对大鼠非酒精性脂肪性肝病的防治作用观察

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实用肝脏病杂志 2012年第6期15卷 548-550页

作者：陈潇迪熊全张霹云陶林熊吉冯吉陈东风第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科重庆市400042 武警四川成都医院消化内科

目的观察多烯磷脂酰胆碱对大鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的预防作用。方法选用Wistar大鼠48只,随机分为正常组(14只)、模型组(14只)、预防组(10只)和治疗组(10只)。模型组大鼠在高脂饮食喂养12周成功诱导出NAFLD模型。预防组提前应用... 详细信息

目的观察多烯磷脂酰胆碱对大鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的预防作用。方法选用Wistar大鼠48只,随机分为正常组(14只)、模型组(14只)、预防组(10只)和治疗组(10只)。模型组大鼠在高脂饮食喂养12周成功诱导出NAFLD模型。预防组提前应用多烯磷脂酰胆碱胶囊干预4周,再加用高脂饮食处理12周;治疗组给予模型动物多烯磷脂酰胆碱胶囊治疗12周。采用Western Bloting法检测肝组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和固醇调节元件结合蛋白1-c(SREBP-1c)表达。结果在12周时,与模型组比较,预防组和治疗组大鼠肝脏脂肪变程度减轻,血清ALT、AST、TG、FFA水平显著下降(P<0.01);正常组肝组织GRP78和SREBP-1c表达量分别为12.35±0.50和10.09±0.52,而模型组分别为40.67±1.72和34.67±1.54,预防组分别为17.97±0.89和15.73±0.58,治疗组分别为18.07±0.81和17.82±3.28(P<0.01);预防组与治疗组间以上各个指标比较,差异无统计学意义。结论多烯磷脂酰胆碱胶囊对单纯高脂饮食诱导的NAFLD大鼠有治疗作用,但预防性用药无明显效果。

关键词：非酒精性脂肪性肝病多烯磷脂酰胆碱葡萄糖调节蛋白78 固醇调节元件结合蛋白1-c 大鼠

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胃肠超声造影与声脉冲辐射力成像诊断胃壁常见良恶性病变的对比研究

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临床超声医学杂志 2020年第7期22卷 519-522页

作者：万晓强张霹雲陈佳肖潇重庆大学附属中心医院消化内科重庆市400010

目的对比分析胃肠超声造影与声脉冲辐射力成像(ARFI)对胃壁常见良恶性病变的诊断价值。方法回顾性分析67例胃壁增厚患者的临床资料,根据病理结果分为良性组49例和恶性组18例。两组患者均行胃肠超声造影和ARFI,比较胃半排空时间(t1/2)、... 详细信息

目的对比分析胃肠超声造影与声脉冲辐射力成像(ARFI)对胃壁常见良恶性病变的诊断价值。方法回顾性分析67例胃壁增厚患者的临床资料,根据病理结果分为良性组49例和恶性组18例。两组患者均行胃肠超声造影和ARFI,比较胃半排空时间(t1/2)、胃窦动力指数(MI)及剪切波速度(SWV);绘制受试者工作特征(ROC)曲线比较上述指标对胃壁常见恶性病变的诊断效能。结果良性组和恶性组患者的t1/2分别为(73.04±18.65)min和(84.20±21.44)min,MI分别为63.37±21.05和52.22±16.55,差异均有统计学意义(均P<0.05)。良性组和恶性组患者的SWV分别为(1.38±0.26)m/s和(2.41±0.74)m/s,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析显示,t1/2、MI、SWV诊断胃壁常见恶性病变的截断值分别为100.625 min、62.42、1.66 m/s,敏感性分别为38.9%、50.0%、87.9%,特异性分别为100%、51.0%、81.8%,曲线下面积分别为0.671、0.260、0.935。结论 ARFI诊断胃壁常见良恶性病变的价值优于胃肠超声造影,可为临床诊断胃壁常见良恶性病变提供新思路。

关键词：声脉冲辐射力成像超声检查造影剂胃壁病变,良恶性

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lncRNA-PVT1通过Hp/CagA介导的胃黏膜屏障损伤促进胃癌的发病机制研究

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肿瘤学杂志 2022年第10期28卷 841-846页

作者：张霹雲刘梁英万晓强肖潇陈佳周礼重庆大学附属中心医院重庆400014 重庆市红十字会医院(江北区人民医院) 重庆400020

[目的]探讨lncRNA-PVT1通过Hp/CagA介导的胃黏膜屏障损伤促进胃癌的发病机制。[方法]检测lncRNA-PVT1在CagA阳性幽门螺杆菌菌株(Hp-CagA~+)和CagA基因敲除突变体(Hp-ΔCagA-)感染的人胃癌上皮细胞系AGS中的表达。过表达PVT1,分为对照组... 详细信息

[目的]探讨lncRNA-PVT1通过Hp/CagA介导的胃黏膜屏障损伤促进胃癌的发病机制。[方法]检测lncRNA-PVT1在CagA阳性幽门螺杆菌菌株(Hp-CagA~+)和CagA基因敲除突变体(Hp-ΔCagA-)感染的人胃癌上皮细胞系AGS中的表达。过表达PVT1,分为对照组和PVT1组。qPCR和荧光原位杂交技术测定lncRNA-PVT1的表达,CCK8和流式细胞术检测细胞活力及凋亡率。检测细胞中活性氧(ROS)水平,透射电子显微镜(TEM)观察细胞中线粒体的超微结构;Western blot检测两组中细胞周期蛋白CDK4和cyclinD1,凋亡蛋白BAX、Bcl-2和裂解的caspase3,线粒体裂变相关蛋白DRP1和MFN2,紧密连接蛋白(occludin,claudin-1和ZO-1)的表达。[结果 ] lncRNA-PVT1在Hp-CagA~+感染AGS细胞中表达增加。过表达PVT1后增加Hp-CagA~+感染AGS细胞中增殖,降低了其凋亡,调节HpCagA~+感染AGS细胞中CDK4(1.22±0.02 vs 1.65±0.03)和cyclinD1(1.16±0.05 vs 1.53±0.01)的表达,增加了ROS生成的增加和线粒体膜电位(MMP)而升高了细胞的比例,增加了线粒体脊的肿胀畸形,降低了DRP1的磷酸化和MFN2(1.16±0.06 vs 0.59±0.03)和BAX(1.05±0.06 vs 1.40±0.03)的表达,升高了Bcl-2(1.66±0.03 vs 1.24±0.02)和裂解的caspase3(1.03±0.06 vs 1.71±0.02)的表达,增加了氧化应激反应诱导的线粒体功能障碍。过表达PVT1通过降低紧密连接蛋白occludin(4.13±0.05 vs 1.31±0.02)、claudin-1 (5.03±0.06 vs 1.33±0.03)和ZO-1 (1.48±0.04 vs 0.60±0.01)表达增加了细胞屏障。[结论]lncRNA-PVT1通过Hp/CagA介导的胃黏膜屏障损伤促进胃癌的发病,促进肿瘤形成和发展。

关键词：胃癌 lncRNA-PVT1 Hp/CagA 胃黏膜屏障

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双歧杆菌三联活菌胶囊联合多烯磷脂酰胆碱对NAFLD患者肝功能、脂糖代谢及炎症因子的影响

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现代生物医学进展 2020年第14期20卷 2719-2722,2780页

作者：万晓强郑紫丹张霹雲陈佳刘代江彭鹏重庆大学附属中心医院/重庆市急救医疗中心消化内科重庆400014

目的:探讨双歧杆菌三联活菌胶囊联合多烯磷脂酰胆碱对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者肝功能、脂糖代谢及炎症因子的影响。方法:选取我院收治的123例NAFLD患者,根据乱数表法将患者分为对照组(n=61)和研究组(n=62),其中对照组给予多烯磷... 详细信息

目的:探讨双歧杆菌三联活菌胶囊联合多烯磷脂酰胆碱对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者肝功能、脂糖代谢及炎症因子的影响。方法:选取我院收治的123例NAFLD患者,根据乱数表法将患者分为对照组(n=61)和研究组(n=62),其中对照组给予多烯磷脂酰胆碱治疗,研究组在对照组的基础上联合双歧杆菌三联活菌胶囊治疗,比较两组临床疗效、肝功能、脂糖代谢及炎症因子,记录两组治疗期间不良反应情况。结果:研究组治疗12周后的临床总有效率为82.26%(51/62),高于对照组的63.93%(39/61)(P0.05)。结论:双歧杆菌三联活菌胶囊联合多烯磷脂酰胆碱治疗NAFLD,用药安全性较好,疗效确切,可有效改善患者肝功能、炎症因子水平及脂糖代谢。

关键词：多烯磷脂酰胆碱双歧杆菌三联活菌胶囊非酒精性脂肪性肝病肝功能脂糖代谢炎症因子

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气候变化对青藏高原生态系统分布范围和生态功能的影响研究进展

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气候变化研究进展 2024年

作者：欧阳志云张观石应凌霄中国科学院生态环境研究中心/城市与区域生态国家重点实验室

近40年来，气候变化导致青藏高原暖湿化，对森林、灌丛、草地、湿地和荒漠等生态系统的地理分布格局和功能产生了明显影响。灌丛、草地和湿地分布范围扩大、边界向西和高海拔区域扩展。气候变化影响下，青藏高原生态系统生产力、固碳和... 详细信息

近40年来，气候变化导致青藏高原暖湿化，对森林、灌丛、草地、湿地和荒漠等生态系统的地理分布格局和功能产生了明显影响。灌丛、草地和湿地分布范围扩大、边界向西和高海拔区域扩展。气候变化影响下，青藏高原生态系统生产力、固碳和土壤保持能力得到改善，水源涵养变化在空间上表现出显著的异质性。气候变化对植物物候、植物生长速率、动植物分布范围和物种相互作用，以及生物多样性的显著影响，还有待更深入观测与研究。

关键词：气候变化生态系统生态功能青藏高原

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