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CFA／Ⅰ重组克隆定居因子菌毛抗原的纯化及形态学观察

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军事医学科学院院刊 1994年第2期18卷 127-132页

作者：李淑琴张兆山王飞夏志平军事医学科学院生物工程研究所新疆军区医学研究所解放军农牧大学病理教研室

用基因重组技术获得的高效表达肠毒素大肠杆菌定居日子抗原Ⅰ（ＣＦＡ／Ⅰ）的重组克隆，通过匀浆破碎、硫酸铵分级盐析部分纯化，再经超速离心及ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０柱层析，得到了ＣＰＡ／Ⅰ的纯化样品，得率约为０．９... 详细信息

用基因重组技术获得的高效表达肠毒素大肠杆菌定居日子抗原Ⅰ（ＣＦＡ／Ⅰ）的重组克隆，通过匀浆破碎、硫酸铵分级盐析部分纯化，再经超速离心及ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０柱层析，得到了ＣＰＡ／Ⅰ的纯化样品，得率约为０．９ｍｇ／ｇ湿菌。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）显示一条蛋白质带，其分子量为１５ｋＤａ，与天然ＣＦＡ／Ⅰ相同。免疫扩散和蛋白质印迹试验证明，纯化的重组克隆ＣＦＡ／Ⅰ与天然ＣＦＡ／Ⅰ具有相同的抗原性及免疫原性。并在电镜下观察了ＣＦＡ／Ⅰ的菌毛形态。

关键词：大肠杆菌定居因子抗原纯化 ETEC

两种跨膜蛋白携带myc于细胞表面的能力比较

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生物工程学报 2008年第11期24卷 1888-1894页

作者：刘庆军韩化敏张兆山高斌中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所北京100071 中国科学院微生物研究所北京100101

在细胞表面表达具有某种功能的蛋白后,这些细胞就具备了某些新功能,可以对其进行功能研究和应用。将功能蛋白连接到某些跨膜蛋白的胞外区是实现目的蛋白表达于细胞表面的手段之一。本研究比较了2种跨膜蛋白A2TM和△LNGFR携带外源蛋白-my... 详细信息

在细胞表面表达具有某种功能的蛋白后,这些细胞就具备了某些新功能,可以对其进行功能研究和应用。将功能蛋白连接到某些跨膜蛋白的胞外区是实现目的蛋白表达于细胞表面的手段之一。本研究比较了2种跨膜蛋白A2TM和△LNGFR携带外源蛋白-myc于细胞表面的能力。利用重叠PCR法合成的A2TM和△LNGFR基因片段与载体pEF/myc/ER和载体LL3.7进行酶切、连接、转化、鉴定,成功构建了pEF-A2TM、pL-A2TM和pL-LN真核表达载体。利用磷酸钙沉淀法转染293FT细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达、流式细胞术检测myc在细胞表面的表达情况,Western blotting检测myc目的蛋白的表达。pL-A2TM和pL-LN转染293FT细胞36 h后的荧光强度基本相同,表明A2TM和△LNGFR在细胞内表达的强度相似。流式细胞术分析显示,△LNGFR和A2TM均可在细胞表面表达,但A2TM只有在指示蛋白EGFP表达非常高的情况下才能在细胞表面被检测到。Western blotting显示△LNGFR表达量很高,而A2TM没有达到检测水平。结果表明,以糖基化形式存在的△LNGFR比没有糖基化的内源A2TM的表达更稳定,A2TM在表达量低时可能易被细胞内的蛋白酶降解,因而△LNGFR是一种能携带外源蛋白于细胞表面的比较理想的跨膜蛋白。

关键词：跨膜蛋白 myc抗原决定簇细胞表面表达差异

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抑瘤素-M(OSM)在原核系统中的表达

军事医学科学院院刊 1998年第2期22卷 88-91页

作者：曹勇李淑琴张兆山文立民军事医学科学院生物工程研究所

目的和方法：抑瘤素－Ｍ是一种具有多种生物活性的细胞因子，采用ＰＣＲ的方法在ＯＳＭ全长的ｃＤＮＡ基础上截去编码Ｃ端的３１个氨基酸的核苷酸序列，将其分别克隆至ｐＢＶ２２０和ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎＴＭ表达系统中进行表达，并对... 详细信息

目的和方法：抑瘤素－Ｍ是一种具有多种生物活性的细胞因子，采用ＰＣＲ的方法在ＯＳＭ全长的ｃＤＮＡ基础上截去编码Ｃ端的３１个氨基酸的核苷酸序列，将其分别克隆至ｐＢＶ２２０和ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎＴＭ表达系统中进行表达，并对其包涵体进行初步的变性、复性和活性测定。结果和结论：证实了截去Ｃ端３１个氨基酸之后，ＯＳＭ仍保持其抑制活性。构建重组质粒ｐＢＶ２２０－ＯＳＭ、ｐＴＦ－ＯＳＭ。

关键词：抑瘤素-M pBV220 PCR扩增原核系统表达

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美国对生物工程的管理

军事医学科学院院刊 1997年第3期21卷 227-229页

作者：文立民张兆山王锦梅黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所

简要介绍了美国对生物工程管理的历史、一般性政策、相关部门各自的管理政策以及国际上其他国家对生物工程管理的政策，这些内容将对我国的生物工程管理有一定的参考价值。

关键词：管理美国生物工程政策

Vi抗原影响产肠毒素大肠杆菌菌毛在人伤寒沙门菌表面的装配

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中华微生物学和免疫学杂志 2001年第1期21卷 14-17页

作者：韩照中张兆山李淑琴苏国富黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所北京100071

目的　观察人伤寒沙门菌Vi抗原对大肠杆菌菌毛抗原装配的影响。方法　利用体内、外同源重组系统 ,构建了VipR基因缺失突变的人伤寒沙门菌菌株 ,导致其Vi抗原的表达较相应野生菌株偏低。用包含产肠毒素大肠杆菌菌毛抗原基因的表达质粒分... 详细信息

目的　观察人伤寒沙门菌Vi抗原对大肠杆菌菌毛抗原装配的影响。方法　利用体内、外同源重组系统 ,构建了VipR基因缺失突变的人伤寒沙门菌菌株 ,导致其Vi抗原的表达较相应野生菌株偏低。用包含产肠毒素大肠杆菌菌毛抗原基因的表达质粒分别转化Vi表达弱化菌株和相应野生菌株 ,对两者表达的菌毛抗原进行含量分析。结果　产肠毒素大肠杆菌CS3、CFA Ⅰ在VipR突变体菌株表面的含量 ,均比在相应野生菌株表面的含量高。结论　Vi抗原的表达弱化可能有利于菌毛抗原在人伤寒沙门菌表面的装配。本研究结果对于产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗的构建有指导意义。

关键词： VI抗原人伤寒沙门菌产肠毒素大肠杆菌菌毛抗原

肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原CS6和霍乱毒素B亚基在人伤寒沙门菌中的共表达及其免疫学效果观察

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军事医学科学院院刊 2003年第1期27卷 5-9页

作者：应天翼韩照中王恒 冯尔玲张兆山苏国富军事医学科学院生物工程研究所北京100071

目的 :构建表达肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原基因CS6和霍乱毒素B亚基 (CTB)基因的细菌性腹泻基因工程多价疫苗。方法 :以基因工程减毒的人伤寒沙门菌为抗原载体 ,利用基于asd基因功能互补的宿主染色体_质粒平衡致死表达系统 ,实现了在没有... 详细信息

目的 :构建表达肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原基因CS6和霍乱毒素B亚基 (CTB)基因的细菌性腹泻基因工程多价疫苗。方法 :以基因工程减毒的人伤寒沙门菌为抗原载体 ,利用基于asd基因功能互补的宿主染色体_质粒平衡致死表达系统 ,实现了在没有抗生素选择压力的条件下 ,CS6和CTB在人伤寒沙门菌中的稳定表达。结果与结论 :检测结果表明 ,CS6和CTB的表达虽对宿主菌的生长有一定影响 ,但经过一段时间的培养 ,重组菌株仍可达到高密度生长。动物免疫结果显示 ,重组菌株在家兔体内均可诱生相应抗体 ,但从诱生的抗体效价、抗体持续时间方面评价 ,单独表达CS6与CTB的重组菌株的免疫学效果均好于两者共表达的重组菌株 ,提示在以后的疫苗研究实践中 ,可以考虑将分别表达CS6与CTB的重组菌株按一定比例混合 ,组成联合疫苗 ,用于细菌性腹泻的免疫预防。本研究结果对于细菌性腹泻基因工程多价疫苗的构建有指导意义。

关键词：肠毒素类大肠杆菌细菌性腹泻基因工程多价疫苗霍乱霉素沙门菌伤寒宿主-质粒平衡致死系统

心肌缺血再灌注期间硒拮抗自由基损伤机理的临床研究

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中华医学杂志 1999年第10期79卷 731-734页

作者：黄益民刘艳霞张兆山韩玲刘丹晶刘舒柏华北京市心肺血管疾病研究所 100029 军事医学科学院全军分子遗传学重点实验室

目的通过临床对硒制剂的使用观察，从基因表达水平探讨心肌缺血再灌注期间微量元素硒拮抗自由基损伤的分子机理。方法将患有单纯房间隔或室间隔缺损的病人分为对照组（23例）和服硒组（23例），服硒组于心脏手术前口服硒制剂共7天。利... 详细信息

目的通过临床对硒制剂的使用观察，从基因表达水平探讨心肌缺血再灌注期间微量元素硒拮抗自由基损伤的分子机理。方法将患有单纯房间隔或室间隔缺损的病人分为对照组（23例）和服硒组（23例），服硒组于心脏手术前口服硒制剂共7天。利用生化、原子吸收、逆转录PCR（RTPCR）、基因测序等技术，对以上两组病人于心肌缺血前和再灌注30分钟时的心肌脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性、硒（Se）、钙（Ca2+）、镁（Mg2+）等离子浓度、GPXmRNA表达阳性率及其CDNA核苷酸序列进行测定和组间比较。结果（1）服硒7天未引起服硒组病人于心肌缺血前的血浆和血细胞Se含量明显变化;（2）再灌注后服硒组病人红细胞Se含量明显降低，心肌Se含量明显增加，心肌GPX活性的增加幅度小于对照组（8.5％比37.3％），MDA含量比缺血前有所降低;（3）服硒组无论在缺血前或再灌注后心肌GPXmRNA表达阳性率都比对照组高（缺血前分别为73.9％、39.1％，再灌注后分别为82.6％、60.9％），而对两组心肌cDNA核苷酸测序结果证明均为细胞型谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）。结论补硒组通过提高心肌缺血再灌注30分钟时心肌的Se含量和GPX1表达水平，发挥拮抗自由基对心肌细胞的脂质过氧化损伤作用。

关键词：心肌缺血再灌注损伤硒自由基损伤

表达CS3菌毛和CT-B抗原双价疫苗候选株的构建

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中华微生物学和免疫学杂志 1997年第5期17卷 348-351页

作者：董自正李淑琴张兆山黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所

肠毒素性大肠杆菌（ＥｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＥＴＥＣ）是引起幼儿腹泻和旅游者腹泻的重要致病菌。本研究的目的是构建既具有抗菌能力又有中和毒素能力的工程菌株。本研究以Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉ... 详细信息

肠毒素性大肠杆菌（ＥｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＥＴＥＣ）是引起幼儿腹泻和旅游者腹泻的重要致病菌。本研究的目的是构建既具有抗菌能力又有中和毒素能力的工程菌株。本研究以Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ质粒为载体构建了表达ＣＳ３和ＣＴ－Ｂ的双价重组抗原的克隆株。口服免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠和肌肉注射免疫家兔，该重组菌株可以诱发抗ＣＴ－Ｂ和抗ＣＳ３的双重免疫应答，为构建多价腹泻疫苗株奠定了基础。

关键词：肠毒素大肠杆菌 CS3菌毛基因重组疫苗

表达幽门螺杆菌过氧化氢酶的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

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第一军医大学学报 2003年第2期23卷 101-105页

作者：白杨张亚历王继德张兆山周殿元第一军医大学南方医院全军消化病研究所广东广州510515 军事医学科学院生物工程研究所北京100071

目的构建表达幽门螺杆菌(Hp)过氧化氢酶的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗。方法采用缺失腺苷酸环化酶(△cya)、环腺苷酸受体蛋白(△crp)及天门冬氨酸β-半醛脱氢酶(△asd)的鼠伤寒沙门菌(X4072)作为宿主,将编码过氧化氢酶的基因CAT插入A... 详细信息

目的构建表达幽门螺杆菌(Hp)过氧化氢酶的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗。方法采用缺失腺苷酸环化酶(△cya)、环腺苷酸受体蛋白(△crp)及天门冬氨酸β-半醛脱氢酶(△asd)的鼠伤寒沙门菌(X4072)作为宿主,将编码过氧化氢酶的基因CAT插入Asd+的组成型表达载体pYA248,通过两次转化引入宿主菌,构建表达过氧化氢酶基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4072(pYA248-CAT)。采用桥联法ELISA测定X4072(pYA248-CAT)培养上清液和裂解上清液中过氧化氢酶的抗原性,参照Meacock的方法及重组菌生长曲线的测定来确定重组菌株的稳定性,通过C57BL/6小鼠口服测定半致死量来确定重组菌的安全性。结果成功构建了表达过氧化氢酶的减毒鼠伤寒沙门菌重组菌株X4072(pYA248-CAT)。桥联法ELISA测定表明重组菌X4072(pYA248-CAT)培养上清中过氧化氢酶的含量高于菌体裂解液;重组菌pYA248-CAT在没有选择压力的情况下培养25代,随机挑选的重组菌全部都能生长,且在ELISA测定过氧化氢酶抗原时均显阳性;重组菌的生长曲线测定表明,X4072(pYA248)和X4072(pYA248-CAT)的生长状态基本一致。口服重组菌株X4072(pYA248-CAT) 1.0×1010 cfu,30 d后C57BL/6存活率仍为100%。

关键词：幽门螺杆菌过氧化氢酶小儿鼠伤寒沙门菌感染疫苗环苷酸受体蛋白