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反向遗传学技术在动物RNA病毒研究中的应用进展

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中国兽医科学 2024年第7期54卷 962-967页

作者：关飞虎宋亚芬温立佳王丽华李丹张辉张乾义王静中国兽医药品监察所北京100081 石河子大学动物科技学院新疆石河子832000 全国畜牧总站北京100125

反向遗传学操作系统的出现为RNA病毒在体外研究提供了一种重要的技术方法,使在精确位置对病毒基因组进行修饰成为可能。病毒的反向遗传系统通常构建在高拷贝数或低拷贝数的质粒中,通过对基因进行改造或插入外源基因等操作实现对病毒改... 详细信息

反向遗传学操作系统的出现为RNA病毒在体外研究提供了一种重要的技术方法,使在精确位置对病毒基因组进行修饰成为可能。病毒的反向遗传系统通常构建在高拷贝数或低拷贝数的质粒中,通过对基因进行改造或插入外源基因等操作实现对病毒改造的目的,被广泛应用于RNA病毒研究的各个领域,从毒力基因到抗病毒筛选和疫苗开发,为研究病毒蛋白的结构与功能、解析其感染致病机制、新型疫苗构建等提供技术平台。本文就反向遗传操作系统的构建方法、面临的问题和解决思路及在动物RNA病毒中的实际应用进行了综述,为新发和再发动物疫病筛选新型药物靶点、新的基因功能挖掘提供技术支撑。

关键词： RNA病毒反向遗传病毒拯救感染性克隆

1株B基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

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中国兽医学报 2024年第1期44卷 44-51页

作者：张倩王旭韩猛立张星星吴桐忠钟发钢黄新张乾义新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室新疆石河子832000 中国兽医药品监察所北京100081

为探究新疆某集约化牛场1~6月龄犊牛群中牛副流感病毒3型(BPIV3)的感染情况,对采集的60份犊牛鼻拭子样品进行RT-PCR检测、病毒分离鉴定及全基因组测序和遗传进化分析。结果显示,样品中BPIV3核酸阳性率为11.67%。从核酸阳性样品中分离获... 详细信息

为探究新疆某集约化牛场1~6月龄犊牛群中牛副流感病毒3型(BPIV3)的感染情况,对采集的60份犊牛鼻拭子样品进行RT-PCR检测、病毒分离鉴定及全基因组测序和遗传进化分析。结果显示,样品中BPIV3核酸阳性率为11.67%。从核酸阳性样品中分离获得1株BPIV3,并命名为XJ21032-1(45),其基因组全长为15512 bp;遗传进化分析表明,XJ21032-1(45)属于BPIV3 B基因型,该分离株与澳大利亚的BPIV3 B基因型参考株Q5592(EU277658)的同源性最高为93.4%。本研究成功分离得到了1株B基因型BPIV3,证实B型毒株在我国的存在和流行,为BPIV3疫苗研发提供了原材料,也有助于我国BPIV3分子进化规律及溯源的进一步研究。

关键词：牛副流感病毒3型 B基因型分离鉴定全基因组序列分析

基于真核CMV启动子构建猪瘟病毒感染性cDNA克隆与病毒拯救

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中国预防兽医学报 2024年第6期46卷 561-567,607页

作者：关飞虎王静宋亚芬温立佳田野蒋颖杨承槐张辉张乾义石河子大学动物科技学院新疆石河子832000 中国兽医药品监察所北京100081 全国畜牧总站北京100125

为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切... 详细信息

为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切位点突变消失作为拯救病毒的遗传标记。将构建的质粒转染PK-15细胞培养后,收集细胞上清盲传3代后通过RT-PCR扩增蛋白编码基因,并经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。RT-PCR鉴定结果显示扩增到CSFV特异性基因;IFA结果显示接种病毒的细胞出现绿色荧光。表明病毒拯救成功,将其命名为BAC-rSM。将BAC-rSM株在PK-15细胞中连续传18代,将第18代病毒经RT-PCR扩增E2基因,并对遗传标记的位点经Afe I酶切和鉴定,分析BAC-rSM病毒的遗传稳定性,结果显示第18代BAC-rSM株遗传标记稳定存在,表明拯救的病毒具有遗传稳定性。将BAC-rSM和SM株病毒分别以MOI 1感染PK-15细胞,在感染后不同时间点收获病毒并测定病毒滴度,结果显示BAC-rSM和SM株生长动力学特征基本一致。对第18代BAC-rSM株与SM株进行全基因组序列比对分析,利用在线软件***/对Erns和E2蛋白二级结构预测,采用荧光定量PCR(qPCR)对BAC-rSM和SM株感染PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平。全基因测序比对分析结果显示,BAC-rSM株基因组共存在46个碱基突变,经预测其Erns和E2的突变导致各自的二级结构改变;qPCR检测结果显示,相对SM感染的PK-15细胞,BAC-rSM感染后8 h和24 h PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01)。本研究建立了一种简单、操作方便的CSFV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展CSFV的分子生物学、毒力决定因素、分子发病机制、疫苗开发和病毒与宿主相互作用的研究提供了新的技术方法。

关键词：猪瘟病毒 CMV启动子感染性克隆反向遗传操作系统

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禽用活病毒载体疫苗的研究进展

中国兽药杂志 2024年第8期58卷 70-79页

作者：王丽华宋亚芬张兵张乾义赵永达杨承槐中国兽医药品监察所(农业农村部兽药评审中心) 北京100081 青岛农业大学山东青岛266000 青岛博霖生物科技有限公司山东青岛266000

疫苗接种是家禽疾病防控最有效的策略之一,随着分子生物学的发展,重组DNA技术被广泛用于许多新型家禽疫苗的构建和生产中。就近年来常用的火鸡疱疹病毒、鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、禽痘病毒、新城疫病毒等活病毒载体疫苗研究进展... 详细信息

疫苗接种是家禽疾病防控最有效的策略之一,随着分子生物学的发展,重组DNA技术被广泛用于许多新型家禽疫苗的构建和生产中。就近年来常用的火鸡疱疹病毒、鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、禽痘病毒、新城疫病毒等活病毒载体疫苗研究进展进行综述,分析其临床应用、优缺点等,为开发更加安全有效的家禽活病毒载体疫苗提供参考。

关键词：家禽病毒载体疫苗

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猪瘟病毒C株表位突变毒株的构建及拯救

畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 698-705页

作者：刘元杰徐璐朱元源徐嫄张乾义李翠李明夏应菊王琴刘业兵赵启祖邹兴启中国兽医药品监察所国家猪瘟参考实验室北京100081

本研究旨在突变猪瘟病毒C株WH303位点,构建感染性克隆,为猪瘟病毒C株标记疫苗的研究提供候选毒株。本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经重叠PCR方法突变WH303位点,再分别连接至C株和C-flag株全长感染性克隆。体外转录RNA,转染PK15细胞,细... 详细信息

本研究旨在突变猪瘟病毒C株WH303位点,构建感染性克隆,为猪瘟病毒C株标记疫苗的研究提供候选毒株。本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经重叠PCR方法突变WH303位点,再分别连接至C株和C-flag株全长感染性克隆。体外转录RNA,转染PK15细胞,细胞连续传代完成病毒的拯救和增殖。结果显示,经特异性限制内切酶酶切反应验证,感染性克隆构建成功。经RT-PCR、过氧化物酶单层细胞试验检测,表明病毒成功拯救。病毒细胞传代至17代,检测到病毒,表明病毒可以稳定传代。综上,本研究成功构建了C株WH303突变感染性克隆MC和MC-flag,并成功拯救MC株,得到可以稳定传代的病毒株。

关键词：猪瘟病毒 C株 WH303位点突变感染性克隆

甲型H1N1流感病毒A/Sichuan/01/2009株反向遗传操作系统的建立

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甲型H1N1流感病毒A/Sichuan/01/2009株反向遗传操作系统的建立

作者：张乾义甘肃农业大学

学位级别：硕士

A型流感病毒在温血动物中广泛存在,也是目前导致人类和各种动物流感疾病的主型。在自然情况下流感病毒感染的宿主范围有一定的特异性,分离自人的流感病毒一般不能在鸡、鸭等禽类体内复制,同样禽流感病毒在灵长类动物体内的复制能力也极... 详细信息

A型流感病毒在温血动物中广泛存在,也是目前导致人类和各种动物流感疾病的主型。在自然情况下流感病毒感染的宿主范围有一定的特异性,分离自人的流感病毒一般不能在鸡、鸭等禽类体内复制,同样禽流感病毒在灵长类动物体内的复制能力也极差。但近年来不断发生禽流感病毒(包括H5N1,H9N2,H7N7亚型病毒)直接传染给人的事件。研究证实,流感病毒的致病性及跨种间传播的深层原因是病毒分子结构差异及其与宿主细胞相互作用。病毒多种结构蛋白和非结构蛋白某些功能位点上氨基酸的差异是病毒致病性及其跨种传播的分子生物学基础。2009年4月初,在墨西哥和美国边境发生了流感疫情,此次疫情通过人与人传播,几周后传播到了全球30多个国家,世界卫生组织(WHO)不断提升全球流感疫情警戒等级,将其升至最高级(6级)。通过对病原的分离鉴定,WHO宣布这场21世纪的第一次流感大流行是由一种新型猪源H1N1亚型流感病毒(novel swine-origin influenza virus A H1N1)引起。这种新型的流感病毒的遗传背景十分复杂,是一种多元重组病毒,其血凝素(HA)基因源于1918年猪流感病毒,其它基因源于人、禽和欧洲猪流感病毒。此前虽然也发生过多起猪流感感染人事件,但传播范围及其局限,此次的猪流感病毒为何能够跨越种间屏障,在人与人之间形成了有效传播成为人们关注的焦点。为了了解此次流感的传播机制,本研究选取了甲型H1N1流感病毒A/Sichuan/01/2009(SC/01)株为亲本毒株,构建了SC/01的8质粒反向遗传操作系统,并获得了甲型H1N1流感病毒救获株Rescue-A/Sichuan/01/2009(R-SC/01)。对救获毒株R-SC/01进行全基因序列测定,证明救获毒株与亲本毒株核苷酸序列完全一致。R-SC/01的小鼠半数感染量及受体结合特性与亲本野毒SC/01相一致。SC/01反向遗传操作系统的成功建立为进一步开展甲型H1N1流感病毒的生物学特性研究,特别是跨宿主传播机制研究奠定了基础。

关键词： A型流感病毒 H1N1流感病毒致病性跨种传播反向遗传操作系统

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猪瘟病毒抗原表位的研究进展

中国兽医杂志 2017年第7期53卷 72-75页

作者：孙永芳徐璐张乾义王琴中国兽医药品监察所北京海淀100081

猪瘟病毒（CSFV）是黄病毒科瘟病毒属成员，为单股正链RNA病毒，病毒核酸长约为12．3kb，由5’-非编码区（5’UTrt）、一个开放阅读框（ORF）和3’-非编码区（3’-UTR）构成，开放阅读框编码3898个氨基酸的前体蛋白，在合成过程中被病... 详细信息

猪瘟病毒（CSFV）是黄病毒科瘟病毒属成员，为单股正链RNA病毒，病毒核酸长约为12．3kb，由5’-非编码区（5’UTrt）、一个开放阅读框（ORF）和3’-非编码区（3’-UTR）构成，开放阅读框编码3898个氨基酸的前体蛋白，在合成过程中被病毒自身编码的或宿主细胞内的蛋白酶水解为4种结构蛋白和8种非结构蛋白，迄今为止发现与抗原相关的蛋白有3种，分别为结构蛋白Erns、E2和非结构蛋白NS3。

关键词：猪瘟病毒抗原表位非结构蛋白正链RNA病毒开放阅读框非编码区前体蛋白蛋白酶水解

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猪瘟诊断技术

兽医导刊 2017年第21期 32-33页

作者：张乾义中国兽医药品监察所OIE猪瘟参考实验室

一、猪瘟临床症状1.最急性型猪瘟。突然死亡;突然发病,表现为全身痉挛、四肢抽搐,皮肤和粘膜发绀。2.急性和亚急性型猪瘟。急性发病期为6-20 d,亚急性为21-30 d;发病率、死亡率高达90%;白细胞数量严重下降,不及正常猪的1/2;体温升至41℃... 详细信息

一、猪瘟临床症状1.最急性型猪瘟。突然死亡;突然发病,表现为全身痉挛、四肢抽搐,皮肤和粘膜发绀。2.急性和亚急性型猪瘟。急性发病期为6-20 d,亚急性为21-30 d;发病率、死亡率高达90%;白细胞数量严重下降,不及正常猪的1/2;体温升至41℃-42℃以上;食欲下降或停止;精神极度沉郁、扎堆;病后不久,病猪全身无力、走路不稳,后躯表现明显。

关键词：猪瘟诊断技术白细胞数量急性型临床症状突然死亡食欲下降发病期

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猪瘟病毒增殖特性研究进展

中国兽药杂志 2015年第11期49卷 59-64页

作者：张玉杰徐璐张乾义王琴中国兽医药品监察所北京100081

从猪瘟病毒在体内外的增殖特性、病毒蛋白在RNA复制中的作用两个方面对猪瘟病毒的增殖规律进行了阐述,以期为猪瘟病毒致病机理的研究提供参考。

关键词：猪瘟病毒增殖特性复制