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猪传染性胃肠炎病毒核衣壳N蛋白基因的克隆与鉴定

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中国兽医科技 2002年第1期32卷 8-11页

作者：唐丽杰师东方李一经王荣军东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

根据文献已发表的猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)cDNA基因序列 ,设计和合成 1对引物 ,以TGEVTH 98强毒株基因组mRNA为模板 ,通过RTPCR技术扩增其N基因 ;将RTPCR产物按正确的阅读框架 (ORF)定向克隆到载体pProEXHTb上 ,重组质粒PHN转化进大... 详细信息

根据文献已发表的猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)cDNA基因序列 ,设计和合成 1对引物 ,以TGEVTH 98强毒株基因组mRNA为模板 ,通过RTPCR技术扩增其N基因 ;将RTPCR产物按正确的阅读框架 (ORF)定向克隆到载体pProEXHTb上 ,重组质粒PHN转化进大肠埃希氏菌DH5α株 ,通过酶切分析及序列测定表明已成功获得了TGEVN基因的无性繁殖体系。TH 98强毒株的N基因与Purdue 115株、FS772 / 70株、TO14株、96193 3株及TFⅠ株的核苷酸序列的同源性分别为 99%、97%、97%、95 %和 96% ,氨基酸序列的同源性分别为 99%、97%、98%、96%和 97%。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 N基因克隆鉴定核衣壳

大肠杆菌F_5菌毛胶体金免疫层析检测方法的建立

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中国兽医科学 2010年第11期40卷 1166-1170页

作者：杨旭东刘文鑫冯瑜菲胡文霞师东方东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立一种特异、稳定、敏感的检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析方法,用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗F5菌毛单克隆抗体,并喷涂在结合垫上;将纯化的兔抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上,分... 详细信息

为建立一种特异、稳定、敏感的检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析方法,用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗F5菌毛单克隆抗体,并喷涂在结合垫上;将纯化的兔抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线;组装试纸条,进行敏感性、特异性、稳定性、重复性试验,并对模拟样品和临床样品进行初步检测。结果显示,对F5菌毛蛋白的最小检出量为38.2μg/mL;与大肠杆菌F4、F6、F41和F18ab菌毛无交叉反应;4℃条件下密封保存120d后仍能有效检出样品;批内、批间检测F5菌毛蛋白的结果没有差别且检测线清晰,具有良好的重复性;对14份临床样品检测的结果与间接夹心ELISA、平板凝集试验、PCR的符合率为100%。

关键词：胶体金免疫层析产肠毒素大肠杆菌 F5菌毛

旋毛虫谷氨酸脱羧酶基因的原核表达及其活性研究

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中国兽医科学 2015年第2期45卷 132-136页

作者：周兴东王泽宋铭忻师东方东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

采用RT-PCR从旋毛虫中扩增出谷氨酸脱羧酶(TsGAD)基因全长,将其克隆到表达载体pET-30a(+)后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,应用比色法鉴定表达产物(rTsGAD)的酶活性,并用纯化的GAD蛋白制备多克隆抗体。结果显示,成功构建... 详细信息

采用RT-PCR从旋毛虫中扩增出谷氨酸脱羧酶(TsGAD)基因全长,将其克隆到表达载体pET-30a(+)后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,应用比色法鉴定表达产物(rTsGAD)的酶活性,并用纯化的GAD蛋白制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-TsGAD,经SDS-PAGE分析,rTsGAD蛋白的分子质量约为57ku。利用比色法测得粗提的rTsGAD具有酶活性,酶活力为1.5U。制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶65 536。Western-blot分析结果显示,该多克隆抗体与TsGAD具有较强的反应性。结果表明,本试验成功原核表达了rTsGAD,并制备了多克隆抗体,为TsGAD定位以及进一步研究旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制奠定了基础。

关键词：旋毛虫谷氨酸脱羧酶原核表达酶活性

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鸡空肠弯曲菌对SPF雏鸡致病性研究

黑龙江畜牧兽医 1997年第11期 4-8页

作者：师东方刘文周陈满路高力杨贵罕周志勇东北农业大学动物医学系哈尔滨市靠河寨种鸡场

用鸡空肠弯曲菌（Ｃａｍｐｙｔｏｂａｃｅｃｒｉｅｊｕｎ：）对１日龄ＳＰＦ（Ｓｐｃｉｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｃｅ）雏鸡进行感染实验。随机将６０只１日龄ＳＰＦ雏鸡分为４组，那和对照组，每组１５只。分别用含菌７．５Ｘ１０８... 详细信息

用鸡空肠弯曲菌（Ｃａｍｐｙｔｏｂａｃｅｃｒｉｅｊｕｎ：）对１日龄ＳＰＦ（Ｓｐｃｉｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｃｅ）雏鸡进行感染实验。随机将６０只１日龄ＳＰＦ雏鸡分为４组，那和对照组，每组１５只。分别用含菌７．５Ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ、７．５ｘ１０４ＣＦＵ／ｍｌ，７．５×１０２ＣＦＵ／ｍｌ布氏肉汤菌液经口时ｔ、Ｊ、Ｉ组接种。接种后分别于２、４、６，８、１０日踏踏机取３只／组、经剖构观察病理变化；从心血、肝、胆汁、脾、肠内容物分离病原菌，测量肠道内物空肠弯曲菌菌数。得出以下结论；经口接种３．７５ｘ１０２ＣＦＵ空场弯曲菌即可造成１日龄ＳＰＦ雏鸡感染发病；感染鸡的主要病理变化为肝脏表面有点状，条索状或片状出血，同时伴有形状不规则大小不等的黄白色坏死灶，盲肠膨大充满气泡，十二指肠、空肠、直肠粘膜有散在的小出血点，首选检苗材料为胆汁、其次是脾、肝等器宫。

关键词：空肠弯曲菌 SPF雏鸡致病性鸡病

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有机磷农药遗传毒性的研究进展

养殖技术顾问 2012年第8期 221-222页

作者：孙璐璐师东方东北农业大学动物医学院 15000 黑龙江职业学院 150111

有机磷农药（organophosphatepesticides，OPPs）是国内生产和使用较多的一类农药，生产量占全国农药总产量的一半以上。据报道，1997年，我国农业用农药总产量35．7万吨，其中有机磷农药20万吨左右，约占整个农药产量的57％。南于其杀... 详细信息

有机磷农药（organophosphatepesticides，OPPs）是国内生产和使用较多的一类农药，生产量占全国农药总产量的一半以上。据报道，1997年，我国农业用农药总产量35．7万吨，其中有机磷农药20万吨左右，约占整个农药产量的57％。南于其杀虫范围广，毒性较小等特点，在农业病虫害防治上被广泛使用，但也对环境造成了严重的污染。

关键词：有机磷农药遗传毒性农业病虫害防治总产量杀虫范围生产量农业用

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A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

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中国兽医科技 2002年第6期32卷 18-20页

作者：徐宏军师东方李一经王君伟贾永清东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

利用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增出A群猪轮状病毒 (PRV)G5型OSU株长度约为 1.0kb的基因片段 ,将其克隆到 pMD 18 T载体上进行测序鉴定 ,证明为该PRV的VP7蛋白基因 ,与已发表的该PRVVP7基因序列的同源性为 99.8%。将该基因黏端克... 详细信息

利用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增出A群猪轮状病毒 (PRV)G5型OSU株长度约为 1.0kb的基因片段 ,将其克隆到 pMD 18 T载体上进行测序鉴定 ,证明为该PRV的VP7蛋白基因 ,与已发表的该PRVVP7基因序列的同源性为 99.8%。将该基因黏端克隆至表达载体PblueBAChisC质粒中 ,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子。纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac N Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒。通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定 ,确定PRV VP7基因已正确插入。将经 3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后 ,获得了重组杆状病毒PRV

关键词：猪轮状病毒 VP7基因克隆重组杆状病毒

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及抗体检测ELISA方法的建立

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中国预防兽医学报 2014年第7期36卷 542-546页

作者：董井泉张蕾马波师东方王君伟东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

为鉴定Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)VP1蛋白优势抗原区及建立DHV-Ⅰ抗体检测ELISA方法,本研究以重组质粒pEasy-VP1为模板,将其分为5段(VP1-a^e)及全长VP1经PCR扩增,并分别克隆于pET-32a(+)进行原核表达。经western blot分析表明,截短表达的蛋... 详细信息

为鉴定Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)VP1蛋白优势抗原区及建立DHV-Ⅰ抗体检测ELISA方法,本研究以重组质粒pEasy-VP1为模板,将其分为5段(VP1-a^e)及全长VP1经PCR扩增,并分别克隆于pET-32a(+)进行原核表达。经western blot分析表明,截短表达的蛋白VP1-c(80 aa^150 aa)抗原性良好。将其纯化作为包被抗原建立了DHV-Ⅰ抗体的间接ELISA检测方法。经反应条件优化确定:VP1-c包被浓度为2μg/mL,DHV-Ⅰ抗血清稀释度为1∶20,其临界值为0.208。该方法能够特异性检测DHV抗体,与其他常见的几种鸭病阳性血清无交叉反应;其批内和批间重复性试验变异系数均小于9%。应用建立的ELISA方法对48份鸭血清进行了检测,与中和试验相比较,符合率为86.9%。表明该方法可以初步应用于DHV抗体的检测和血清流行病学调查。

关键词：鸭肝炎病毒 VP1蛋白抗原优势区间接ELISA

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猪水肿病大肠杆菌基因突变株的构建

中国预防兽医学报 2007年第11期29卷 830-835页

作者：付海兵丁琳杨春柳许亚卓师东方东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

应用定点突变技术将野生型猪水肿病大肠杆菌（O139）主要毒力基因SLT—ⅡeA亚基中第167位谷氨酸和第170位精氨酸，分别突变为谷氨酰胺（E167Q）和亮氨酸（R170L）后，获得突变基因SLT—Ⅱe^＊。通过同源重组，将野生菌中的毒力基因SLT—... 详细信息

应用定点突变技术将野生型猪水肿病大肠杆菌（O139）主要毒力基因SLT—ⅡeA亚基中第167位谷氨酸和第170位精氨酸，分别突变为谷氨酰胺（E167Q）和亮氨酸（R170L）后，获得突变基因SLT—Ⅱe^＊。通过同源重组，将野生菌中的毒力基因SLT—Ⅱe替换为SLT．Ⅱe^＊，构建了一株毒力基因突变株（SLT-Ⅱe^＊）。实验结果显示，该突变菌株对Vero细胞的毒性是野生菌毒性的1／500.

关键词：猪水肿病大肠杆菌 SLT—Ⅱe 同源重组突变菌

牛源产Ⅱ型不耐热肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及重组毒素制备

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畜牧兽医学报 2014年第8期45卷 1336-1341页

作者：袁超文刘文鑫关玮琨孟相秋唐杰李星月赵志腾师东方东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

产Ⅱ型不耐热肠毒素(LT-Ⅱ)大肠杆菌是一类能引起严重腹泻的人畜共患肠道致病菌。为了解LT-Ⅱ在牛源腹泻性大肠杆菌中的流行情况,本研究对2010-2012年间分离的138株大肠杆菌进行了LT-Ⅱ毒素基因的检测,对分离到的10株LT-Ⅱ阳性大肠杆菌... 详细信息

产Ⅱ型不耐热肠毒素(LT-Ⅱ)大肠杆菌是一类能引起严重腹泻的人畜共患肠道致病菌。为了解LT-Ⅱ在牛源腹泻性大肠杆菌中的流行情况,本研究对2010-2012年间分离的138株大肠杆菌进行了LT-Ⅱ毒素基因的检测,对分离到的10株LT-Ⅱ阳性大肠杆菌进行了测序及分析。进一步将LT-Ⅱcl毒素基因双顺反子的ORF克隆入pET30a表达载体、转化Rossatta感受态并诱导表达重组LT-Ⅱcl毒素,经Y-1小鼠肾上腺皮质细胞对重组毒素进行了初步的毒性验证。结果显示,所分离的10株LT-Ⅱ阳性大肠杆菌中,有8株表达LT-Ⅱcl毒素,1株表达LT-Ⅱc4毒素,1株表达LT-Ⅱc6毒素。SDS-PAGE和Western Blot结果表明成功地制备出LT-Ⅱcl重组毒素,该重组毒素可以使Y-1小鼠肾上腺皮质细胞发生明显的病变,其细胞最小致死量为17.8 pg。本研究为中国国内首次分离到牛源产LT-Ⅱ型不耐热肠毒素大肠杆菌,为深入研究LT-Ⅱ毒素奠定了基础。

关键词：大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素重组毒素细胞毒性