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毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶研究

毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶研究

作者：左小虎安徽大学

学位级别：硕士

胞内菌的治疗是目前临床医疗的难题之一。如结核分枝杆菌、沙门伤寒菌、嗜肺军团菌等胞内菌,它们通常寄生在人体吞噬细胞内,往往会对人体造成慢性持续性感染。当这些病菌侵染人体后会被吞噬细胞吞噬,但吞噬细胞不能像裂解大肠杆菌等非... 详细信息

胞内菌的治疗是目前临床医疗的难题之一。如结核分枝杆菌、沙门伤寒菌、嗜肺军团菌等胞内菌,它们通常寄生在人体吞噬细胞内,往往会对人体造成慢性持续性感染。当这些病菌侵染人体后会被吞噬细胞吞噬,但吞噬细胞不能像裂解大肠杆菌等非胞内菌那样将其杀死。例如胞内菌中的结核分枝杆菌已演化出了逃逸吞噬细胞裂解的机制,它通过阻止其所在吞噬泡的酸化进程,来阻止吞噬泡与溶酶体的融合。这样结核分枝杆菌就能长期寄生在胞内,并在人体免疫能力下降时侵染周围细胞。胞内菌的治疗主要是用抗生素等抗菌药长期疗法,大多数的抗生素等抗菌药治疗胞外菌疗效好,但它们很难进入细胞内或入胞浓度低难以杀死胞内寄生菌,并且长期用药也容易产生耐药菌。为探索解决胞内菌的治疗难题,本研究利用毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶,并利用该酶具有的甘露糖残基是巨噬细胞表面甘露糖受体的配体这一特点,研究利用巨噬细胞受体与配体之间的相互作用介导甘露糖化人溶菌酶内吞,以达到杀死寄生在巨噬细胞内病菌的目的。巨噬细胞等吞噬细胞是人体的固有免疫细胞,它们构成人体的第二道防线。巨噬细胞能通过细胞表面受体来识别入侵机体的病原体,在众多的表面受体中,甘露糖受体是重要的病原体模式识别受体之一。巨噬细胞能通过甘露糖受体的介导作用,将带有甘露糖糖链修饰的病原体内吞到胞内。因此利用甘露糖残基修饰的药物靶向巨噬细胞是一条值得探索的药物递送途径。巴斯德毕赤酵母表达系统是成功的蛋白分泌表达系统之一,该系统能对蛋白进行多种翻译后加工修饰,如能特异性在NXS/T(X为除脯氨酸以外的所有氨基酸)位点的天冬酰胺上进行外侧链为甘露糖残基的糖基化修饰。利用毕赤酵母的这一特性,可以使具有N-糖基化位点的蛋白进行甘露糖化修饰。人溶菌酶具有水解细菌肽聚糖层中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡糖胺之间的β-1.4糖苷键能力,它能杀死革兰氏阳性菌,在体内的补体的帮助下对革兰氏阴性菌也有一定的抑杀作用,因此具有潜在的药用价值。但是天然的人溶菌酶没有N-糖基化位点,理论上用毕赤酵母表达该蛋白也不会产生N-糖基化修饰。为获得甘露糖化修饰的人溶菌酶及对其相关特性的研究,本实验从以下几个方面进行：1、利用毕赤酵母表达甘露糖化修饰的人溶菌酶突变体本研究得到C-端融合2个N-糖基化位点序列的人溶菌酶突变体的融合基因,并以此构建了pPICZaA-hLYZ-myc-His载体,将该载体转化毕赤酵母GS115菌株。得到重组菌分泌表达的蛋白通过SDS-PAGE分析显示为一弥散的条带,弥散蛋白相对分子质量(Mr)位于20-45kDa之间。取其中Mr最小的带做肽指纹图谱分析,结果该重组蛋白的氨基酸序列与人源溶菌酶lysozyme precursor(EC3.***.1.17)的氨基酸重合率达36%;Western印迹表明弥散的重组蛋白均能与鼠抗人溶菌酶单克隆抗体特异性结合;重组蛋白经过PNGase F酶切分析,SDS-PAGE显示弥散条带消失,在理论Mr附近出现一条分子量均一的条带;用伴刀豆蛋白A(ConA)对该重组蛋白进行检测,结果表明该重组蛋白可以与ConA特异性结合。以上结果表明得到的重组蛋白为甘露糖化修饰的人溶菌酶。2、甘露糖化修饰的人溶菌酶可以被巨噬细胞内化通过构建人溶菌酶与增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的融合基因载体pPICZaA-hLYZ/eGFP,电转GS115构建重组菌GS115/pPICZaA-hLYZ/eGFP,该重组菌诱导表达重组融合蛋白,通过硫酸铵沉淀、G25柱脱盐、镍亲和层析纯化获得目的重组融合蛋白,脱去咪唑与盐后冻干浓缩,将该重组融合蛋白与Raw264.7细胞共孵育,用激光共聚焦显微镜观察,发现有绿色荧光物质进入Raw264.7,而在有甘露糖竞争性配体甘露聚糖存在时,观察不到有绿色荧光物质进入Raw264.7细胞。此现象说明甘露糖化人溶菌酶能进入巨噬细胞且这一过程是由甘露糖受体介导的。3、低甘露糖化糖基酵母工程菌GJK05表达人溶菌酶及其活性鉴定通过构建pPICZaA-hLYZ载体及用作对照的载体pPICZaA-hLYZ(N/Q),电转化低糖基化酵母工程菌及GS115菌株,分别构建重组菌表达重组蛋白hLYZ及hLYZ(N/Q)。用伴刀豆蛋白A(ConA)检测重组蛋白的甘露糖化修饰;平板抑菌圈法比较重组人溶菌酶的活性,发现GS115表达高甘露糖化的重组人溶菌酶影响了其抑菌的活性。低糖基化酵母工程菌GJK05表达的重组人溶菌酶与Raw264.7进行免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜可观察到Raw264.7细胞内有荧光物质。综上述：本研究获得了具有活性的甘露糖化的重组人溶菌酶,该重组蛋白具有体外抑菌活性,并且能够在巨噬细胞表面的甘露糖受体的介导下进入巨噬细胞,为进一步研究甘露糖化人溶菌酶的胞内抑菌活性奠定基础。

关键词：毕赤酵母人溶菌酶糖基化 eGFP

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硝酸盐对土壤反硝化活性及蒽厌氧降解的影响

环境科学 2018年第1期39卷 422-429页

作者：代军帅左小虎王明霞姚炎红周志峰西南大学资源环境学院重庆400715

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)在土壤中的反硝化降解是其厌氧去除的重要途径之一,但严格厌氧条件下反硝化电子受体(硝酸盐)对土壤反硝化活性及PAHs降解影响的报道还不多见.通过添加硝酸盐和蒽的厌氧微宇宙培养实验,... 详细信息

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)在土壤中的反硝化降解是其厌氧去除的重要途径之一,但严格厌氧条件下反硝化电子受体(硝酸盐)对土壤反硝化活性及PAHs降解影响的报道还不多见.通过添加硝酸盐和蒽的厌氧微宇宙培养实验,探讨厌氧条件下硝酸盐对土壤蒽的厌氧降解及反硝化活性的影响.设置了不添加(N0)和添加硝酸盐(N30:30mg·kg^(-1))的两组处理,每组处理分别含3个蒽浓度(A0:0 mg·kg^(-1)、A15:15 mg·kg^(-1)、A30:30 mg·kg^(-1)),共6个处理(N_0A_0、N_0A_(15)、N_0A_(30)、N_(30)A_0、N_(30)A_(15)、N_(30)A_(30)).厌氧条件下25℃黑暗培养45 d,并于第3、7、15及45 d测定土壤N2O和CO2的产生速率、反硝化相关功能基因(nar G、nir K、nir S)丰度及蒽含量.结果表明,在培养第3 d检测到较强的反硝化活性,且硝酸盐及蒽均能显著促进土壤的反硝化酶活性.随着培养时间的延续,各处理中土壤反硝化活性急剧下降,蒽对土壤反硝化活性却表现出明显的抑制作用.方差分析的结果也表明,硝酸盐、蒽及其交互作用均能显著影响土壤的反硝化活性.3种反硝化功能基因中,只有narG和nirS基因的丰度在培养期间呈现逐渐升高的趋势,且它们能够受到硝酸盐、蒽及其交互作用的显著影响.厌氧条件下土壤蒽的最终去除率在33.83%~55.01%之间,添加硝酸盐对土壤蒽的去除率和降解速率均无显著影响,但高蒽含量(N_0A_(30)、N_(30)A_(30))处理的降解速率显著高于低蒽含量(N_0A_(15)、N_(30)A_(15))处理(P<0.05).综上,硝酸盐的添加能显著影响土壤的反硝化活性及与反硝化相关的narG和nirS基因的丰度,但对土壤蒽的厌氧降解无显著影响.

关键词：土壤厌氧培养硝酸盐反硝化酶活性蒽降解

典型油田多环芳烃污染对土壤反硝化微生物群落结构的影响

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环境科学 2016年第12期37卷 4750-4759页

作者：姚炎红王明霞左小虎李振轮罗锋周志峰西南大学资源环境学院重庆400715

油田区土壤具有潜在的PAHs(polycyclic aromatic hydrocarbons)污染风险,而以硝酸根为电子受体的反硝化作用可能在PAHs的厌氧代谢中起到重要作用.以具有50多年历史的江汉油田区域为对象,从该油田的油井口附近采集了9个土壤样品,编号为JH... 详细信息

油田区土壤具有潜在的PAHs(polycyclic aromatic hydrocarbons)污染风险,而以硝酸根为电子受体的反硝化作用可能在PAHs的厌氧代谢中起到重要作用.以具有50多年历史的江汉油田区域为对象,从该油田的油井口附近采集了9个土壤样品,编号为JH-1~JH-9,以反硝化相关的nir K(Cu-亚硝酸还原酶基因)和nirS(细胞色素cd1-亚硝酸还原酶基因)为分子标识,通过定量PCR及克隆文库结合T-RFLP(terminal-restriction fragment length polymorphism)的方法,研究典型油田区土壤反硝化微生物的群落结构,并探讨其与土壤环境因子之间的关系.结果表明,该油田区土壤中nirK基因的丰度高于nirS基因,PAHs含量最高的土壤样品(JH-4)中反硝化功能基因nir K和nir S的丰度均最低,相关性分析表明,土壤nir K及nirS基因的丰度均与土壤PAHs含量呈显著负相关(nirK:R2=0.54,P<0.05;nirS:R^2=0.58,P<0.05).克隆文库及T-RFLP的结果则表明,该油田土壤中nirK基因的群落组成在不同样品间的变异较大,且PAHs含量最高的JH-4中该基因的群落组成与其它各样品有明显的不同,RDA(redundancy analysis)的分析结果进一步表明除有效氮、有效磷外,土壤PAHs含量也是影响nirK型反硝化微生物群落组成的重要因子.相较于nirK,该油田区土壤中nirS基因的群落组成在不同样品间的差异较小,但发现nirS型假单胞菌的丰度与土壤PAHs含量呈正相关,表明具备较强有机污染物降解能力的假单胞菌属可能在该区域土壤PAHs的反硝化代谢中起到重要作用.

关键词：油田土壤反硝化 PAHs nirK nirS 群落结构

江汉油田区典型农田土壤烃类降解微生物功能基因bssA的遗传多样性研究

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土壤学报 2017年第3期54卷 794-803页

作者：左小虎王明霞姚炎红李振轮周志峰西南大学资源环境学院重庆400716

油田区土壤易受烃类物质影响并可能富集了特异的石油烃降解微生物类群。针对江汉油田区5个不同油井口附近的典型旱地农田土壤,采用石油烃(Petroleum hydrocarbons,PHs)中苯系物代谢的关键功能基因-bssA(苯甲基琥珀酸合成酶基因)作为分... 详细信息

油田区土壤易受烃类物质影响并可能富集了特异的石油烃降解微生物类群。针对江汉油田区5个不同油井口附近的典型旱地农田土壤,采用石油烃(Petroleum hydrocarbons,PHs)中苯系物代谢的关键功能基因-bssA(苯甲基琥珀酸合成酶基因)作为分子标识物,通过克隆文库结合末端限制性片段长度多样性(Terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)的方法,研究该油田区土壤含有bssA基因的烃类降解微生物群落结构,并探讨其环境驱动机制。结果表明,土壤中PAHs含量在0.21~2.01mg kg^(-1)之间,石油烃污染程度较低。T-RFLP的分析表明不同土壤样品中的bssA基因多样性差异明显,PAHs(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,多环芳烃)含量最高土壤中bssA基因多样性最高,其优势bssA基因类群与硫酸盐还原菌或地杆菌有较近的亲缘关系。冗余分析进一步表明,土壤硝态氮、有效磷、PAHs含量均是影响bssA基因多样性的重要因子。这些结果表明:江汉油田区典型农田土壤中含有bssA基因的主要类群为β-变形菌和δ-变形菌,并与地杆菌属(Geobacter)、索氏菌属(Thauera)和固氮菌属(Azoarcus)具有较近的系统发育亲缘关系。这些微生物可能通过硝酸盐、硫酸盐及铁还原代谢过程降解土壤PAHs。

关键词：土壤厌氧降解苯甲基琥珀酸合成酶基因(bssA) 群落结构

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PTA氧化过滤干燥系统典型问题及对策

聚酯工业 2021年第1期34卷 12-16页

作者：谭帅王涛涛左小虎中国石油化工股份有限公司洛阳分公司河南洛阳471012

介绍了精对苯二甲酸(PTA)装置氧化过滤干燥系统存在的典型问题,系统分析了产生这些问题的原因,并提出相应的对策。

关键词：精对苯二酸过滤干燥问题对策

甘露糖化hLYZ/eGFP融合蛋白的表达纯化及巨噬细胞定位

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军事医学 2012年第4期36卷 248-252页

作者：左小虎刘波巩新唱韶红胡晓李海燕张部昌曹诚吴军军事医学科学院生物工程研究所北京100071 沈阳药科大学生命科学与生物制药学院沈阳110016 安徽大学生命科学学院合肥230039

目的利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ);进而利用巨噬细胞(macrophage,MR)表面的甘露糖受体(mannose receptor,MR)将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨... 详细信息

目的利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ);进而利用巨噬细胞(macrophage,MR)表面的甘露糖受体(mannose receptor,MR)将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础。方法为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化。毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)的竞争性配体甘露聚糖(mannan)的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞。结果毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量(Mr)为(66～97)×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F(PNGaseF)酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致。该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生。结论毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞。

关键词：糖基化人溶菌酶 eGFP 巨噬细胞毕赤酵母甘露糖

机器人与腹腔镜手术系统在骶骨固定术中应用与疗效的Meta分析

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机器人外科学杂志（中英文） 2021年第1期2卷 28-37页

作者：何勇杨将张小艺王治左小虎洪莉武汉大学人民医院妇产科湖北武汉430000

目的:比较机器人骶骨固定术(Robotic sacrocolopexy,RSC)与腹腔镜骶骨固定术(Laparoscopic sacrocolopexy,LSC)的临床疗效。方法:检索2020年3月前万方、维普、中国知网(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)、Pubmed、EMbase、Cochrane Library以及Scopus等数据库公开发表的关于RSC和LSC临床疗效比较的研究,采用Cochrane RevMan 5.3软件进行Meta分析。结果:共纳入18篇文献,收集病例2 472例,其中RSC组1 134例,LSC组1 338例。Meta分析结果显示,RSC组手术时间较LSC组长(WMD=37.35,95%CI=24.46~50.24,P0.05)。结论:RSC和LSC均具有高治愈率和低复发的临床疗效,而RSC在手术精细化操作和安全性方面更具有优势,在临床中有较大的应用前景。

关键词：骶骨固定术机器人手术腹腔镜手术临床疗效

PTA氧化反应器尾气冷凝器壳程结垢原因及处理

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聚酯工业 2016年第6期29卷 50-53页

作者：谭帅左小虎侯洪波席占世中国石油化工股份有限公司洛阳分公司河南洛阳471012

针对PTA装置2014年下半年起氧化反应器尾气冷凝器运行工况急剧恶化的原因,进行全面分析探讨,并对检修时采取的措施进行详细的阐述。

关键词： PTA 尾气冷凝器结垢处理

PSA装置C201-3一级右列做功差原因分析及处理措施

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聚酯工业 2024年第5期37卷 35-38页

作者：白易昌韩颖吕怀生左小虎中国石油化工股份有限公司洛阳分公司河南洛阳471000

PSA装置解析气压缩机因发现振动大和异常声音而停机,检修完毕后出现一级右列做功差的现象,结合两次试机过程,并逐项排查各影响因素后,判断为气阀本身密封面失效导致吸入性能变差。结合本次检修的拆解情况,从工艺流程和气阀改型两方面提... 详细信息

PSA装置解析气压缩机因发现振动大和异常声音而停机,检修完毕后出现一级右列做功差的现象,结合两次试机过程,并逐项排查各影响因素后,判断为气阀本身密封面失效导致吸入性能变差。结合本次检修的拆解情况,从工艺流程和气阀改型两方面提出应对措施,以期为相关研究提供参考。

关键词：气阀负荷调节器黏滞力