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鸡新城疫活疫苗（La Sota株）浓缩法纯化抗原生产工艺的建立

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鸡新城疫活疫苗（La Sota株）浓缩法纯化抗原生产工艺的建立

作者：崔小兰华南农业大学

学位级别：硕士

鸡新城疫(Newcastle Disease;ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽类的一种重要的急性败血性传染病,对养禽业的发展造成严重影响,属于家禽重大疫病之一。疫苗的免疫接种能有效预防和控制鸡新城疫的发生与流行,减少鸡... 详细信息

鸡新城疫(Newcastle Disease;ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽类的一种重要的急性败血性传染病,对养禽业的发展造成严重影响,属于家禽重大疫病之一。疫苗的免疫接种能有效预防和控制鸡新城疫的发生与流行,减少鸡群因疫病感染造成的损失。常用于免疫接种的鸡新城疫疫苗有活疫苗和灭活疫苗两大类,活疫苗包括Ⅰ系,Ⅱ系(B1株)、Ⅲ系(F系)、Ⅳ系(La Sota株)和克隆-30等,其中新城疫Ⅳ系活疫苗(La Sota株)是我国最常用的优良低毒力疫苗,长期的应用效果表明La Sota株的免疫效果良好,能够保护鸡免受NDV的感染。在鸡新城疫活疫苗生产过程中,传统的生产工艺是将毒种接种SPF鸡胚,收取尿囊液,按照一定比例进行混合配苗,然后利用冻干技术制成疫苗。这种疫苗在临床使用过程中,可能出现肿头、停食、停水、局部炎症、休克甚至死亡的不良反应,同时也会造成生产性能降低,免疫功能下降,易于发病,对其它疫苗应答下降。鸡只免疫接种产生不良反应是由多种因素造成,这些因素包括内毒素、外毒素、热源、异体蛋白、蛋源、血清、革兰阴性菌和环境。其中,内毒素是导致疫苗接种鸡只出现免疫不良反应的主要因素之一。因此,在鸡新城疫活疫苗(La Sota株)生产过程中,可以通过优化鸡新城疫活疫苗(La Sota株)中间产品生产工艺,减少和避免疫苗内毒素污染,达到提升疫苗的品质,提高疫苗的安全性和有效性的目的。本研究是在当前鸡新城疫活疫苗(La Sota株)成熟的生产工艺基础上,根据新城疫病毒特点来开展试验。试验设计A、B、C和D共四组,其中A、B和C组采用浓缩纯化生产工艺连续进行三批次生产,D组仍采用目前抗原直接配苗进行生产,作为对照组。抗原生产按一定比例作适当稀释毒种,接种SPF鸡胚尿囊腔0.1mL/胚,接种后密封针孔,置36.5℃继续孵化,弃去72h内死亡的鸡胚,收获96h的鸡胚液,测定其血凝价及EID50,检验合格后一部分抗原利用颇尔超滤浓缩系统进行浓缩,浓缩后留取样品备测血凝价及毒价,分别标识为试验A组、B组和C组。另一部分抗原直接按规程规定的效价进行配苗,标识为对照D组;按规程规定的效价进行配苗,连续进行三批次生产,对四组产品进行生产和常规检测,包括内毒素检验、无菌检验、病毒含量测定、安全检验和免疫攻毒试验,通过比较来建立鸡新城疫活疫苗浓缩纯化生产工艺。结果表明:试验A组、B组和C组鸡新城疫活疫苗(La Sota株)10/10安全检测合格,内毒素含量不超过20EU/mL,病毒含量大于106.0EID50,且批次间差异不超过0.1个滴度;对照D组鸡新城疫活疫苗(La Sota株)7/10安全检测合格,内毒素含量超过50 EU/mL,病毒含量大于106.0EID50。通过检测结果比较,表明鸡新城疫活疫苗(La Sota株)浓缩纯化生产工艺建立的必要性,控制原辅料质量,此浓缩纯化生产工艺,不但能有效富集并调控病毒液含量,增加疫苗单位有效成分,降低疫苗使用量,而且同时能除去部分生物源性杂质成分,减少中间产品病毒液内毒素污染,减少批次间的差异,有效降低免疫接种不良反应,从而提升产品质量水平。本次试验确立了鸡新城疫活疫苗(La Sota株)浓缩纯化生产工艺,并有望在未来生产中得到全面推广应用。

关键词：鸡新城疫疫苗浓缩纯化不良反应病毒含量

Sirt1失活通过增加NF-KB的乙酰化来保护TNF-α引起的肝细胞凋亡和肝脏损伤

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Sirt1失活通过增加NF-KB的乙酰化来保护TNF-α引起的肝细胞凋亡和...

作者：崔小兰上海交通大学

学位级别：硕士

急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)是各种肝脏疾病发展而来,以肝细胞的大面积凋亡和坏死为主要特点,而最终导致多脏器衰竭的一种临床综合征。虽然急性肝衰竭发病率低,但它的病程凶险,死亡率极高,严重威胁肝病患者的生命安全。因此,... 详细信息

急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)是各种肝脏疾病发展而来,以肝细胞的大面积凋亡和坏死为主要特点,而最终导致多脏器衰竭的一种临床综合征。虽然急性肝衰竭发病率低,但它的病程凶险,死亡率极高,严重威胁肝病患者的生命安全。因此,探明其中的细胞凋亡的分子机制了解其病理生理过程为寻找新的治疗方案是至关重要的。Sirt1(Sirtuin type 1)是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白脱乙酰酶,为Sirtuins家族成员之一,与细胞增殖、分化、衰老、凋亡和代谢密切相关(1-5)。NF-κB是一种异二聚体蛋白,一般由两个功能亚单位(即P65和P50)组成,在多数细胞类型,NF-kB在胞浆与抑制性蛋白质结合形成无活性的复合物。当肿瘤坏死因子等作用于相应受体后,可通过第二信使Cer等激活此系统,而病毒感染、脂多糖、活性氧中间体、佛波酯、双链RNA以及前述信息传递途径中活化的RKC、PkA等则可直接激活NF-kB。激活过程是通过磷酸化抑制性蛋白使其构象改变而从NF-kB脱落,使得NF-kB得以活化。活化的NF-kB进入细胞核,与DNA接触,并启动或抑制有关基因的转录。核因子kB(NF-kB)体系主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和调亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递。NF-κB(RelA/p65)在TNF-α引起的肝细胞损伤中起保护作用(6-8)。Sirt1可以使NF-κB(RelA/p65)的310位上的赖氨酸残基脱乙酰化从而抑制NF-κB的转录活性,减少其下游基因的表达促进细胞的凋亡。同时,Sirt1也可以使p53脱乙酰化从而抑制p53的活性而抗凋亡(9)。Sirt1在肝细胞凋亡中的作用目前还没有明确的结论。为此,我们进行了下面一些实验:(1)通过cre-loxp系统我们建立了肝脏特异性敲除SIRT1基因的小鼠。通过分别给Sirt1+/+和Sirt1-/-小鼠内毒素(LPS)10μg/Kg联合D-氨基半乳糖胺(D-Galn)700mg/Kg建立急性肝衰竭模型,观察两组的生存率和转氨酶水平。我们观察到Sirt1+/+小鼠组建模后72小时的死亡率为100%,6h时的转氨酶水平明显升高。而Sirt1-/-小鼠组死亡率为0,转氨酶也较Sirt1+/+组明显降低。(2)在细胞水平,我们分别提取Sirt1+/+和Sirt-/-小鼠的原代肝细胞进行培养,以ACTD20ng/ml联合TNF-α20ng/ml建立损伤模型,发现Sirt-/-组肝细胞的损伤明显小于Sirt+/+组。在对两组进行NF-κB siRNA干扰后我们发现,SIRT1敲出后的这种保护作用消失了。(3)我们使用Sirt1的抑制剂尼克酰胺预处理Sirt+/+小鼠后,建立急性肝衰竭模型。结果显示,尼克酰胺有明显的保护作用,预处理后小鼠的生存率明显提高,病理组织改变明显减轻。(4)通过不同时间点TNF-α预处理后NF-κB乙酰化水平的检测,我们发现Sirt1敲出后NF-κB的乙酰化水平明显增高且消退时间延长。进一步采用EMSA实验验证NF-κB与DNA的结合活性,通过提取不同时间点TNF-α预处理后的细胞核蛋白做EMSA发现,在预处理后的1h到2h Sirt1-/-组NF-κB与DNA的结合远大于Sirt1+/+组。因此,我们得出结论,Sirt1的失活通过增加NF-κB在受到TNF-α刺激后乙酰化的水平来发挥对肝细胞的保护作用。

关键词：急性肝衰竭肝脏 Sirt1 NF-KB

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通淋冲剂的主要药效学研究

中国中药杂志 2001年第9期26卷 620-622页

作者：亢泽峰崔小兰图娅陈惠民中国中医研究院眼科医院北京100040 中国中医研究院中药研究所北京100700 北京中医药大学北京100029

目的 :观察通淋冲剂的利尿通淋作用及其对急慢性泌尿感染的影响。方法 :进行体内体外抑菌试验 ,抗炎免疫及利尿试验。结果 :①在体外 ,通淋冲剂对所试的淋球菌等 14株细菌菌株均有不同程度的抑制作用 ;在体内 ,通淋冲剂在 6 .6 g·kg-1... 详细信息

目的 :观察通淋冲剂的利尿通淋作用及其对急慢性泌尿感染的影响。方法 :进行体内体外抑菌试验 ,抗炎免疫及利尿试验。结果 :①在体外 ,通淋冲剂对所试的淋球菌等 14株细菌菌株均有不同程度的抑制作用 ;在体内 ,通淋冲剂在 6 .6 g·kg-1·d-1剂量时对变形杆菌感染引起的小鼠死亡有一定的保护作用。②通淋冲剂对酵母引起大鼠的体温升高有明显的抑制作用。③能显著抑制二甲苯引起的小鼠皮肤毛细血管通透性的增高及抑制大鼠棉球肉芽肿的增生 ,并且对胸腺、脾脏及肾上腺无明显影响。④能不同程度地提高正常小鼠网状内皮系统的吞噬功能 ,对小鼠体液免疫功能无明显作用。⑤对正常大鼠及水负荷大鼠有明显利尿作用。结论 :通淋冲剂有明显的清热利尿 ,抗炎抑菌作用。

关键词：通淋冲剂药效学抗炎作用利尿作用实验研究

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尼克酰胺对急性肝功能衰竭小鼠的保护作用

胃肠病学 2015年第4期20卷 214-219页

作者：崔小兰李大伟夏强上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科 200127

背景:急性肝功能衰竭(AHF)是多种肝脏疾病发展至终末期的共同病理生理过程,病因复杂、诊断困难、死亡率高。目的:研究尼克酰胺在AHF小鼠中的保护作用。方法:腹腔注射D-半乳糖胺700 mg/kg和脂多糖10μg/kg建立小鼠AHF模型。将54只小鼠分... 详细信息

背景:急性肝功能衰竭(AHF)是多种肝脏疾病发展至终末期的共同病理生理过程,病因复杂、诊断困难、死亡率高。目的:研究尼克酰胺在AHF小鼠中的保护作用。方法:腹腔注射D-半乳糖胺700 mg/kg和脂多糖10μg/kg建立小鼠AHF模型。将54只小鼠分为空白对照组、尼克酰胺对照组、AHF模型组、尼克酰胺低、中、高剂量组(400、800、1 000 mg/kg),检测ALT、AST、TNF-α和IL-6水平,HE染色观察肝组织病理学变化,TUNEL法检测肝细胞凋亡情况,蛋白质印迹法检测肝组织Caspase-3蛋白表达。将另外40只小鼠分为AHF模型组、0.9%Na Cl溶液组以及尼克酰胺低、中、高剂量组,动态观察72 h内的小鼠死亡率。结果:与空白对照组和尼克酰胺对照组相比,AHF模型组ALT、AST水平显著升高(P小鼠生存率分别为37.5%、62.5%、100%,均显著高于AHF模型组(P均小鼠有明显的保护作用,并可提高小鼠生存率。

关键词：肝功能衰竭,急性烟酰胺肿瘤坏死因子α 白细胞介素6

微生物来源的乙酰胆碱酯酶抑制剂F99-909A的研究

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中国抗生素杂志 2004年第9期29卷 513-515,525页

作者：郑智慧董悦生路新华张华林洁杨健石英崔小兰金莹华北制药集团新药研究开发中心石家庄050015

研究利用丁酰硫代胆碱和二硫二硝基苯甲酸为底物和显色剂 ,建立一种精确、快速的高通量筛选微生物代谢产物来源的乙酰胆碱酯酶 (ACh E)抑制剂的体外筛选模型。利用此方法从 2 30 0株真菌中筛选到一株阳性菌株 F99- 90 9,该菌株的发酵液... 详细信息

研究利用丁酰硫代胆碱和二硫二硝基苯甲酸为底物和显色剂 ,建立一种精确、快速的高通量筛选微生物代谢产物来源的乙酰胆碱酯酶 (ACh E)抑制剂的体外筛选模型。利用此方法从 2 30 0株真菌中筛选到一株阳性菌株 F99- 90 9,该菌株的发酵液经有机溶剂提取、ODS柱层析及 HPL C制备分离 ,得到一个活性化合物 F99- 90 9A,该化合物对乙酰胆碱酯酶的 IC50 为 9.5μmol/ L。通过对该化合物的紫外、红外、质谱、核磁等理化分析 ,得知该化合物与已知化合物 radiclonic acid结构相同。但该化合物对 Ach

关键词：阿尔茨海默病乙酰胆碱酯酶酶抑制剂

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岩土工程勘察勘探孔布置方法及深度计算

江西建材 2023年第1期 97-98,103页

作者：崔小兰河南建材地质工程勘察院有限公司河南信阳464000

文中结合实际案例,详细分析了岩土工程勘察勘探孔布置方法及深度计算方法,以供参考和借鉴。

关键词：岩土工程勘察勘探孔布置深度计算方法

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咸阳盛夏冰雹落区预报

陕西气象 1996年第3期 4-6页

作者：崔小兰王荷秀咸阳市秦都区气象局陕西省气象台

咸阳盛夏冰雹落区预报崔小兰，王荷秀（咸阳市秦都区气象局咸阳·７１２０００）（陕西省气象台西安，７１００１５）经过多年研究，利用咸阳地区各气象站的实测资料计算出来的地区能量场和风场，对冰雹落区有较好的对应。因为地区小天... 详细信息

咸阳盛夏冰雹落区预报崔小兰，王荷秀（咸阳市秦都区气象局咸阳·７１２０００）（陕西省气象台西安，７１００１５）经过多年研究，利用咸阳地区各气象站的实测资料计算出来的地区能量场和风场，对冰雹落区有较好的对应。因为地区小天气图实际是一种加密观测的天气图，从...

关键词：冰雹个例能量场切变线强对流天气切交线高能舌能量锋区落区预报中小尺度系统咸阳地区

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禽流感抗体的间接ELISA检测

当代畜牧 2005年第12期34卷 10-12页

作者：黄水洪崔小兰广东大华农动物保健品有限公司 527400

本试验建立了AIV抗原,检测AIV抗体的AI-ELISA方法。本试验应用单方阵滴定法确定了酶联免疫吸附试验(ELISA)检测禽流感抗体的最适工作浓度、最适血清稀释倍数,建立了ELISA检测鸭血清抗体的程序,并提出以P/N(Positive/Negidive)确定阳性... 详细信息

本试验建立了AIV抗原,检测AIV抗体的AI-ELISA方法。本试验应用单方阵滴定法确定了酶联免疫吸附试验(ELISA)检测禽流感抗体的最适工作浓度、最适血清稀释倍数,建立了ELISA检测鸭血清抗体的程序,并提出以P/N(Positive/Negidive)确定阳性血清滴度的方法。经小批血清的实验检测表明此方法特异性较好,操作简便,适于大批鸭群抗体水平的检测,并为免疫监测提供了可靠的技术手段。

关键词：禽流感间接酶联免疫吸附试验抗体

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种蛋质量对胚毒苗质量的影响

当代畜牧 2009年第6期38卷 44-46页

作者：崔小兰黄水洪广东大华农动物保健品股份有限公司 527400

近些年来，我国禽用疫苗已占到所有畜禽疫苗产量的95％以上，然而，在多数兽用生物药厂还普遍使用普通鸡胚制苗，用这种普通鸡胚制造疫苗存在两大问题：一是外源病原的污染问题，这种污染既有细菌、支原体，也有病毒，细菌主要是沙门氏菌。

关键词：种蛋质量鸡胚畜禽疫苗污染问题禽用疫苗沙门氏菌支原体细菌